人心果葉不同極性組分的抗氧化與抗菌活性

馬飛躍 張 明 李 婭 杜麗清 帥希祥

(1.中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524091；2.農業部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091；3.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

人心果(Manilkarazapota)為山欖科鐵線子屬常綠喬木的水果，原產于美洲，后經東南亞等地引種至中國[1]。果實味美多汁，富含對人體有益物質，具有潤肺止咳、增強免疫力等作用，目前國內外對其果實成分及其活性研究得較為廣泛[2-4]。人心果葉中多酚和黃酮類物質含量也很豐富[5]57，且具有多種生物活性，如降血糖、降血脂、抗氧化和抗腫瘤等[5]48-52 [6-7]。張秀梅等[8]和陳海芳等[9]在研究多種熱帶果樹葉片抗氧化能力時發現，其中人心果葉表現出極好的抗氧化活性。但目前針對人心果葉的研究多以粗提物為主，甚少有關于其主要活性成分富集純化的研究，且對于其中的抗氧化和抗菌有效組分及成分類別研究也較少，并未明確人心果葉抗氧化和抗菌活性的主要極性組分；在前期研究[10]中發現不同提取方法所得人心果葉粗提物的抗氧化能力存在差異，可能是由于不同提取方法所得粗提物的有效組分不同。而人心果葉各極性組分所含抗氧化物質的種類也可能存在不同，具有抗氧化能力的結構和官能團也會不同。試驗擬采用DPPH自由基、ABTS自由基清除能力和總抗氧化能力方法測定人心果葉不同極性組分(石油醚組分、乙酸乙酯組分、正丁醇組分、水層組分)的抗氧化活性，并評價其抗菌活性，為人心果天然抗氧化劑和抗菌劑的開發以及在食品和醫藥領域的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

人心果葉：中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所種質資源圃；

DPPH：美國Sigma公司；

維生素C：>99.0%，河北源創生物科技有限公司；

維生素E：河北源創生物科技有限公司；

沒食子酸：國藥集團化學試劑有限公司；

FRAP法和ABTS法總抗氧化能力檢測試劑盒：碧云天生物技術有限公司；

其他試劑均為分析純；

金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)、大腸桿菌(ATCC 8739)：黑龍江省科學院應用微生物研究所；

高速藥材調料粉碎機：FZ-06型，浙江溫嶺市百樂粉碎設備廠；

旋轉蒸發儀：Heidolph Hei-VAP Preciscion型，德國海道爾夫公司；

純水儀：RODI-220A1型，廈門銳思捷水純化技術有限公司；

酶聯免疫分析儀：Spark 10M型，帝肯(上海)貿易有限公司；

超聲波提取儀：SK5210HP型，上海科導超聲儀器有限公司；

臺式高速冷凍離心機：MULTIFUGEXIR型，美國Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同極性組分樣品制備 摘取新鮮人心果葉于干燥箱中將其低溫烘干至重量恒定，用粉碎機將其粉碎。稱取適量干人心果葉，按料液比(m人心果葉∶V乙醇)1∶10 (g/mL) 加入80%乙醇，熱回流3 h，趁熱過濾，所得濾渣重復提取3次，合并3次濾液，于50 ℃減壓蒸餾去乙醇后，得粗提物。以蒸餾水溶解粗提物，之后依次用石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(Bu)進行萃取，各極性溶劑按照V粗提物∶V溶劑=1∶1萃取5次，分別合并每個萃取劑的溶液，減壓蒸餾，干燥至恒重(60 ℃)，得到包括水相(Wa)在內的4個不同極性組分的浸膏。

1.2.2 總酚含量測定 采用福林酚法[11]。分別稱取相同質量各極性組分浸膏，以相同體積乙醇和蒸餾水溶解，配制成相同濃度的浸膏溶液。準確吸取各極性組分浸膏溶液0.20 mL，分別加入1.00 mL福林酚試劑(0.1 mol/L)和0.80 mL純水，混勻，靜置5 min，再加入1.00 mL Na2CO3溶液(7.5%)，充分混勻。避光反應2 h，在765 nm處測定吸光度。以維生素C(VC)作為對照品，以沒食子酸質量濃度(50～1 000 mg/L)作為橫坐標(X)，吸光度作為縱坐標(Y)，制作標準曲線：Y=2 078.9X-122.21 (R2=0.998 0)，并根據標準曲線及式(1)計算人心果葉不同極性組分總酚含量。

CP=C1V1/M1，

(1)

式中：

CP——不同極性組分總酚含量，mg/g；

C1——樣品總酚質量濃度，mg/L；

V1——定容的體積，L；

M1——各極性組分浸膏的質量，g。

1.2.3 總黃酮含量測定 采用硝酸鋁比色法[12]。準確吸取各極性組分浸膏溶液1 mL，加10%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，混勻，靜置6 min；加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，混勻，靜置6 min；加1 mol/L NaOH溶液4 mL，定容10 mL，靜置15 min，于510 nm 處測定吸光值。以水溶性維生素E作為對照品，以蘆丁濃度(1.0～5.0 mg/L)作為橫坐標(X)，吸光度作為縱坐標(Y)，制作標準曲線：Y=2.588 1X-0.005 1 (R2=0.999 7)。并根據標準曲線及式(2)計算人心果葉不同極性部位總黃酮含量。

CF=C2V2/M2，

(2)

式中：

CF——不同極性組分總黃酮含量，mg/g；

C2——樣品總黃酮含量，mg/L；

V2——定容的體積，L；

M2——各極性組分浸膏的質量，g。

1.2.4 抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除能力：將各極性組分浸膏分別配置成不同濃度的溶液，準確移取各樣品溶液各0.1 mL，按Ma等[13]的方法測定其DPPH自由基清除能力。

(2) ABTS自由基清除能力：用ABTS法總抗氧化能力檢測試劑盒測定。

(3) 總抗氧化能力：用FRAP法總抗氧化能力檢測試劑盒。用TEAC值，即水溶性維生素E當量來表示人心果葉各極性組分總抗氧化能力。

1.2.5 抗菌活性測定 參照文獻[14]，將菌株保持在恒定的4 ℃瓊脂平板上，并在37 ℃的營養瓊脂孵育24 h。樣品溶液用無菌生理鹽水稀釋不同濃度，在96孔板上每孔加入100 μL不同濃度的樣品溶液和100 μL菌液(105CFU/mL)，在37 ℃下孵育24 h，試驗重復3次。以抑制菌株生長的最低質量濃度為最小抑菌濃度(MIC)；以殺死99.9%細菌數量的最低質量濃度為最小殺菌濃度(MBC)，青霉素作為陽性對照。

1.2.6 統計分析 采用SPSS 17.0軟件對試驗數據進行分析，采用Origin 8.0軟件對分析后的試驗數據進行作圖。

2 結果和分析

2.1 不同極性組分的總酚、總黃酮含量

如圖1所示，人心果葉不同極性萃取組分均含有多酚和黃酮類物質，其含量大小順序為總酚：EA>Bu>Wa>PE，總黃酮：EA>Bu>PE>Wa。不同極性組分之間的總酚和總黃酮含量差異顯著(P<0.05)，其中EA的總酚和總黃酮含量均為最高，分別為(163.47±1.46)，(123.00±1.39) mg/g；PE的總酚含量最低，為(12.26±0.36) mg/g；Wa的總黃酮含量最低，為(22.98±0.83) mg/g，說明石油醚和水不利于富集酚類和黃酮類成分。由于不同種類的多酚和黃酮的極性和溶解性不同，因此，不同極性的萃取溶劑所得萃取組分中多酚和黃酮的種類和含量各不相同。

2.2 不同極性組分的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力 由圖2可知，在試驗范圍內隨各極性組分質量濃度增加，對DPPH自由基的清除能力增強。結合不同極性組分的總酚和總黃酮含量推斷，總酚和總黃酮含量與DPPH自由基清除能力具有一定的正相關性，含量高，則清除率較大。不同極性組分中PE對DPPH自由基的清除能力最低，EA的最高且高于維生素C。雖然Wa的總黃酮含量最低，但其總酚含量高于PE，對DPPH自由基的清除能力也略高于PE，說明Wa中的主要抗氧化活性物質為多酚類物質。EA、Bu、Wa、PE 4種組分及維生素C清除DPPH自由基的IC50值分別為(0.019±0.010)，(0.094±0.013)，(0.137±0.015)，(0.306±0.020)，(0.075±0.015) mg/mL。IC50值越小，其抗氧化能力越強，因此，各極性組分抗氧化活性順序為：EA>Bu>Wa>PE。結果表明，EA和Bu的抗氧化活性較強，后續可對二者進行進一步的分離純化等研究，以及其他生物活性的驗證。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 人心果葉不同極性組分總酚和總黃酮含量Figure 1 Contents of total phenol and total flavonoids of different polar parts from Manilkara zapota leaves

圖2 人心果葉不同極性組分清除DPPH自由基能力Figure 2 DPPH radical scavenging activity of different polar parts from Manilkara zapota leaves

2.2.2 ABTS自由基清除能力 圖3顯示了各極性組分對ABTS自由基的清除能力，所呈趨勢與其對DPPH自由基的清除能力略有差異，在試驗范圍內，隨著樣品質量濃度增加，各組分和水溶性維生素E對自由基的清除率也不斷增加。雖然Wa的總酚或總黃酮含量低于PE和Bu，但其對ABTS自由基清除率高于二者，說明Wa還含有其他抗氧化成分[15]。當提取物質量濃度達到0.50 mg/mL 時，EA對ABTS自由基清除率為58.79%，而其他極性組分在此質量濃度下均未超過50%。

圖3 人心果葉不同極性組分清除ABTS自由基能力Figure 3 ABTS radical scavenging activity of different polar parts from Manilkara zapota leaves

2.2.3 總抗氧化能力 由圖4可知，EA的TEAC值最高，為(5.824±0.234) mmol/g，PE的最低，為(0.492±0.092) mmol/g，其他兩個組分的TEAC值較為相近。總體趨勢與清除DPPH自由基抗氧化能力以及總酚含量趨勢基本保持一致。因此，人心果葉EA的抗氧化能力最強。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 人心果葉不同極性組分的總抗氧化能力Figure 4 The total antioxidant capacity assay of different polar parts from Manilkara zapota leaves

根據2.2.1～2.2.3結果分析，在不同的抗氧化體系中，不同極性組分的不同抗氧化能力大小順序存在差異，可能與采用不同的抗氧化體系和不同極性組分所含抗氧化成分種類不同有關[16]。人心果葉中主要的抗氧化活性物質集中在乙酸乙酯和正丁醇組分，與嘉寶果嫩葉[17]、豆腐柴葉[18]、芒果葉[19]、野地瓜莖[20]等的不同極性組分抗氧化活性結果相類似。其中嘉寶果嫩葉[17]和豆腐柴葉[18]的乙酸乙酯組分和正丁醇組分的抗氧化活性同樣高于其他兩個極性組分，且水相組分對DPPH自由基的清除能力高于石油醚組分，該結果與試驗的研究結果一致。而ABTS自由基清除能力方面，人心果葉水相組分的清除率高于石油醚組分，甚至高于正丁醇組分，與嘉寶果嫩葉[17]和豆腐柴葉[18]的又略有不同。一般石油醚組分和水相組分由于極性相差較大，其所含主要活性物質差異較大，導致在不同抗氧化體系中表現出來的抗氧化能力差異也較大。

對比人心果葉不同極性組分的總酚和總黃酮含量，分析發現幾種不同抗氧化體系表現的抗氧化活性與其總酚和總黃酮含量的相關性存在差異，可能是由不同的抗氧化機理以及自由基清除原理不同導致的；或者是由于不同極性組分所含活性物質之間存在協同作用而導致的差異。例如水相組分雖然總黃酮含量最低，但其對ABTS自由基清除能力高于石油醚組分，以及總酚和總黃酮含量都高的正丁醇組分，表明人心果葉不同極性組分抗氧化活性不僅與總酚和總黃酮含量相關，與其他活性成分及其之間的相互作用也有關。亦有研究[21-23]報道，總酚和總黃酮與其抗氧化活性呈相關性，且相關性存在差異。

2.3 不同極性組分的抗菌活性

由表1可知，人心果葉各極性組分對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌)的抗菌活性較強，而對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的抗菌活性較弱，人心果葉不同極性組分對大腸桿菌的MIC和MBC均大于20 mg/mL，可能是由細菌菌株的細胞膜差異導致的[24]。其中對金黃色葡萄球菌的抑制活性較為明顯，不同極性組分中EA的抗菌活性最強，MIC和MBC分別為0.313，0.625 mg/mL；PE的抗菌活性最弱，MIC和MBC分別為2.500，1.250 mg/mL；Wa的抗菌活性與PE的接近。而對枯草芽孢桿菌也表現出了一定的抑制作用，但其中EA的MIC和MBC分別為5.000，10.000 mg/mL。這一結果與各極性組分抗氧化的結果一致。結合不同極性組分的總酚和總黃酮含量比較發現，抗氧化和抗菌活性與其所含總酚和總黃酮含量密切相關。Wei等[25]的研究也表明，富含總酚和總黃酮的植物具有抗菌潛力，但由于總酚和總黃酮所含物質種類的復雜性，且各成分之間可能存在協同作用等因素，很難將其總的抗菌活性歸因于一種或者幾種物質。

表1 人心果葉不同極性組分抗菌活性Table 1 Minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration(MBC) values of different polar parts from Manilkara zapota leaves mg/mL

3 結論

采用DPPH自由基清除、ABTS自由基清除和總抗氧化能力3種體外抗氧化活性測定的方法來綜合評價人心果葉不同極性組分的抗氧化能力。結果表明，人心果葉各極性組分均具有一定的抗氧化能力和抗菌活性，且在一定質量濃度范圍內，其抗氧化能力的大小和質量濃度之間存在明顯的量效關系；同時表明人心果葉中所含抗氧化及抗菌活性物質的極性范圍分布較廣，種類豐富，可以為天然抗氧化劑和抗菌劑的開發提供物質基礎；且人心果葉各極性組分的抗氧化能力與其總酚和總黃酮含量存在一定的相關性，但并不是簡單的線性相關，各極性組分所含物質種類存在差異，在不同抗氧化體系中表現出的抗氧化能力強弱順序也存在差異。總體上乙酸乙酯組分的抗氧化能力最強，尤其在DPPH自由基清除能力方面，乙酸乙酯組分的清除作用強于維生素C，且其中總酚和總黃酮的含量也最高，抗菌活性也最好，正丁醇組分的抗氧化能力、總酚和總黃酮含量以及抗菌活性次之。因此，后續的研究可從活性指導分離的角度，將乙酸乙酯組分作為其主要的活性成分組分，進行進一步的成分分離、結構鑒定以及探索更多生物活性等方面的研究。同時通過單體成分的分離和鑒定作為研究其相互間協同和拮抗作用的物質基礎。