同位素稀釋—氣質法測定白酒中氨基甲酸乙酯的測量不確定度評定

王開宇 于欣欣 都 蕓 馬燕玲 吳 帥

(煙臺市食品藥品檢驗檢測中心,山東 煙臺 264000)

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是食品在發(fā)酵和貯藏過程中天然產(chǎn)生的污染物，是一種多位點致癌物，可能會導致嚙齒類動物皮膚癌、肝癌等疾病的發(fā)生[1]。2007年，世界衛(wèi)生組織正式將EC歸為2A類致癌物(可能令人類患癌的物質)[2]。酒精飲料在生產(chǎn)中會產(chǎn)生EC，尿素、氫氰酸等物質會與乙醇相互作用生成EC[3]，因此EC污染已成為近年來被高度關注的酒類食品安全熱點問題之一，已有多個國家和國際組織對其限量進行了規(guī)定，日本清酒為100 μg/L，法國、德國和瑞士水果白蘭地分別為1 000，800，1 000 μg/L，美國佐餐葡萄酒為15 μg/L，甜葡萄酒為60 μg/L[4]。目前中國尚未制訂食品中EC的限量標準，但其風險控制應該得到高度重視[5]。例如，姚曉潔等[6]對河南省1 882批白酒中EC含量進行檢測時發(fā)現(xiàn)，52.3%的白酒樣品中檢出了EC，其中最高含量為1 680 μg/kg，平均值為49.9 μg/kg。

目前，國內(nèi)外對EC含量的測定主要有氣相色譜—質譜(GC-MS)、高效液相色譜—質譜(HPLC-MS)、高效液相色譜—熒光檢測(HPLC-FLD)等方法[7]，中國也發(fā)布了檢測標準GB 5009.223—2014《食品安全國家標準 食品中氨基甲酸乙酯的測定》，采用內(nèi)位素稀釋，堿性硅藻土固相萃取，GC-MS檢測，其測量不確定度也有報道。但是，包括其他采用內(nèi)標—標準曲線法的測量不確定度評定普遍存在一些問題，主要是混淆了測量模型與不確定度因素之間的關系，將測量模型中樣品定容體積作為不確定度分量進行評定；此外，測量結果與內(nèi)標液濃度有關，與測量結果有關的不確定度因素未能進行正確分析。

試驗擬依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，以食品安全檢測標準GB 5009.223—2014為例，評定同位素稀釋—標準曲線法的測量不確定度，旨在為分析出影響氨基甲酸乙酯測量結果的主要因素并加以控制，規(guī)范內(nèi)標—標準曲線法的測量不確定度評定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基甲酸乙酯標準品：美國AccuStandard公司；

D5-氨基甲酸乙酯(D5-EC)：美國AccuStandard公司；

甲醇、正已烷：色譜純，德國MERCK公司；

乙酸乙酯、乙醚：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜—質譜聯(lián)用儀：7890B-5977B型，美國安捷倫公司；

電子天平：SQP型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

堿性硅藻土固相萃取柱：Cleanert EC氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 試驗方法

依據(jù)GB 5009.223—2014《食品安全國家標準 食品中氨基甲酸乙酯的測定》。試樣中加入D5-氨基甲酸乙酯同位素內(nèi)標后，經(jīng)堿性硅藻土固相萃取柱凈化、洗脫，濃縮定容，用氣相色譜—質譜儀進行測定，標準曲線內(nèi)標法定量。

1.3.1 標準溶液配制

(2) 氨基甲酸乙酯標準溶液：準確稱取0.100 0 g氨基甲酸乙酯標準品于100 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，得質量濃度為1.00 mg/mL的EC儲備液；再用甲醇逐級稀釋至10.000，0.500 μg/mL的EC中間液。

(3) 混合標準溶液系列：準確吸取0.500 μg/mL的EC中間液20，50，100，200，400 μL和10.0 μg/mL的EC中間液50，100 μL于7個氣相用進樣瓶中；準確吸取100 μL 2.00 μg/mL的D5-EC使用液添加至各瓶中，用甲醇補加至1 mL，渦旋混勻，得到質量濃度分別為10.0，25.0，50.0，100.0，200.0，500.0，1 000.0 ng/mL，含內(nèi)標cD5=200 ng/mL的混合標準溶液。另配制一瓶含內(nèi)標為200 ng/mL 的空白溶液。

1.3.2 樣品處理 精確稱取2.000 g樣品，準確加入2.00 μg/mL 的內(nèi)標D5-EC使用液100 μL，40 ℃氮吹至約0.5 mL后補加水至2 mL，加氯化鈉0.3 g，混勻后加至堿性硅藻土固相萃取柱上，靜置10 min。用10 mL正已烷淋洗后，用10 mL 5%乙酸乙酯—乙醚溶液以約1 mL/min 流速進行洗脫，洗脫液經(jīng)裝有2 g無水硫酸鈉漏斗脫水后，氮吹至約0.5 mL，用甲醇加至約1 mL，混勻，待氣質分析。

1.3.3 氣質條件

(1) 氣相條件：毛細管色譜柱VF-WAXms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度220 ℃；柱溫為初溫50 ℃ 保持1 min，以5 ℃/min升至180 ℃，240 ℃后運行5 min；載氣為氦氣，1 mL/min；不分流進樣，進樣量1 μL。

(2) 質譜條件：電子轟擊源(EI)，溫度230 ℃，70 eV；選擇離子監(jiān)測模式(SIM)；選擇離子：氨基甲酸乙酯m/z44，62，74，89，定量離子62；D5-氨基甲酸乙酯m/z64，76，定量離子64。

1.3.4 進樣分析 內(nèi)標空白溶液進樣1次，內(nèi)標空白溶液中不含目標物氨基甲酸乙酯，不干擾樣品檢測。標準溶液每濃度進樣2次，計算EC與D5-EC峰面積之比，以峰面積之比為縱坐標，EC濃度為橫坐標，繪制標準曲線。樣品每平行樣進樣2次，以峰面積之比平均值從標準曲線計算溶液中EC濃度。

1.3.5 數(shù)學模型的建立 根據(jù)測量原理和方法，按式(1)計算白酒中氨基甲酸乙酯含量。

(1)

式中：

X——樣品中氨基甲酸乙酯含量，μg/kg；

c——樣品溶液中氨基甲酸乙酯質量濃度，ng/mL；

V——樣品處理后定容體積，mL；

m——樣品質量，g；

R——回收率，取1。

2 結果與分析

2.1 測量不確定度分析

對于混合標準溶液：

(2)

由式(2)可知，標準溶液中目標物與內(nèi)標濃度之比與定容體積無關，僅與溶液中目標物與內(nèi)標質量之比有關，樣品溶液亦如此，不必評定定容體積的不確定度[9-10]。

因此，測量結果X的不確定度分量：測量重復性s、樣品溶液濃度c、樣品質量m和回收率R；樣品溶液濃度c的不確定度分量有混合標準溶液、曲線擬合及樣品中加入內(nèi)標使用液體積。

測量不確定度模型:X(u)=Fu[s、c、m、R]。

其中樣品溶液濃度c的不確定度模型為：

c(u)=Fu′[cs、u(曲線擬合)、Vyis]=Fu′[(cs中、Vs中、Vis)、u(曲線擬合)、Vyis]。

具體不確定度來源因果圖見圖1。

圖1 不確定度因果圖Figure 1 Causal relationship diagram of uncertainty

2.2 測量不確定度評定

2.2.1 測量重復性不確定度urA樣品平行6次，其測量結果見表1。

測量重復性不確定度為測量結果平均值的標準偏差，為A類標準不確定度，采用A類評定[11]。

表1 樣品測量結果Table 1 Result of sample measurement

2.2.2 混合標準溶液cs的不確定度 混合標準溶液由標準中間液和內(nèi)標使用溶液配制，需依次評定標準儲備液、標準中間液和吸取溶液體積的不確定度。

(1) EC標準儲備溶液的不確定度

① 標準品稱量質量ms的不確定度：標準品稱量質量0.103 5 g，因質量較小，質量不確定度僅由天平重復性引入[12]。天平檢定證書顯示天平重復性為0.2 mg，根據(jù)JJG 1036—2008《電子天平檢定規(guī)程》，天平重復性為6次檢定稱量質量的極差，按極差法求得重復性標準偏差，6次極差系數(shù)C=2.53，去皮法稱量2次，則質量ms的相對不確定度：

由環(huán)模制粒過程可知，物料在模孔受到來自模孔入口的擠壓力和模孔內(nèi)壁在橫截面內(nèi)的反向支撐作用力，如圖4所示處于三向應力狀態(tài)。取模孔中一微小物料顆粒段進行受力平衡分析，圖中可見物料微元沿模孔軸線方向（x）受到上層物料的擠壓力和下層物料的支撐力以及模孔內(nèi)壁對其產(chǎn)生的滑動摩擦阻力。因此，物料微元要順利從模孔中擠出需要滿足式（1）所示微分平衡方程。

② 質量分數(shù)P的不確定度：氨基甲酸乙酯標準品質量分數(shù)P為99.5%，誤差為±0.5%，服從均勻分布，相對不確定度：

EC標準儲備溶液相對不確定度由標準品稱量質量、質量分數(shù)、定容體積不確定度合成：

(2) EC中間液c中1(10.0 μg/mL)和c中2(0.50 μg/mL)的不確定度：量取1.00 mL EC儲備液，甲醇定容于100 mL，制得EC中間液c中1(10.30 μg/mL)；再量取5.00 mL EC中間液c中1，甲醇定容于100 mL，制得EC中間液c中2(0.515 μg/mL)。

配制中間液及混合標準溶液溫度為(24±2) ℃，溫度引入的不確定度在配制混合標準溶液時合并評定[15]。

① 吸取儲備液體積1.00 mL(V2)的不確定度：A級1.00 mL單標吸量管，容量允差±0.007 mL，按均勻分布，相對不確定度：

② 吸取中間液c中15.00 mL(V3)的不確定度：A級5.00 mL 單標吸量管，容量允差±0.015 mL，按均勻分布，相對不確定度：

③ 定容體積100 mL(V4)的不確定度：100 mL容量瓶均為A級，相對不確定度同ur1(V1)，即ur(V4)=ur1(V)=0.000 577。

EC中間液c中2(0.50 μg/mL)的相對不確定度：

(3) 混合標準溶液的不確定度評定：混合標準溶液的不確定度來源為EC中間液、吸取EC中間液體積及吸取D5-EC內(nèi)標使用液體積。

① 吸取D5-EC內(nèi)標使用液體積100 μL(Vis)的不確定度：因在混標和樣品中D5-EC內(nèi)標使用同一支移液器吸取相同體積100 μL，體積不確定度由移液器測量重復性引入。查JJG 646—2006《移液器標準》，100 μL測量重復性為1.0%，可直接引用，ur(Vis)=1.0%=0.010。

② 吸取EC中間液體積(Vs中)的不確定度：由移液器體積容量允差ΔV(容量允差見JJG 646—2006《移液器》)引入，按均勻分布計算：

(2)

③ 溫度對吸取EC中間液的不確定度ur(Vst)：EC儲備液在20 ℃配制，中間液和混合標準溶液在(24±2) ℃ 配制。溫度升高導致溶液濃度降低，而移液器(移液槍)因溫度升高導致其體積增大，可吸入更多的溶液。溫度引入的不確定度由甲醇體脹系數(shù)、移液器體脹系數(shù)、溫度差及溫度波動共同作用；甲醇體脹系數(shù)β=1.2×10-3℃-1，移液器體脹系數(shù)β移=0.000 45 ℃-1[16]，溫度差Δt1=24-20=4 ℃，溫度波動半寬Δt2=2 ℃；溫度差Δt1引入體積的系統(tǒng)誤差，將其按均勻分布處理成系統(tǒng)不確定度，溫度波動Δt2假設為均勻分布，則溫度引入的相對不確定度為：

④ 各混合標準溶液濃度的相對不確定度：標準溶液系列各濃度不確定度由EC中間液不確定度、吸取體積不確定度(包含溫度的不確定度)、吸取內(nèi)標液體積不確定度引入，按式(3)計算。

ur(ci)=

(3)

經(jīng)計算各濃度不確定度見表2。

表2 混合標準溶液各濃度的相對不確定度Table 2 Relative uncertainty of each concentration of mixed standard solution

⑤ 混合標準溶液系列的不確定度：以標準溶液系列的各相對不確定度的均方根作為混合標準溶液系列的不確定度[17]。

2.2.3 曲線擬合的不確定度 混合標準溶液各濃度測定2次，以平均值計算標準曲線。標準溶液系列測量結果及相關數(shù)值見表3。

表3 標準溶液系列測量結果Table 3 Result of standard solution measurement

樣品溶液濃度由擬合曲線引入的不確定度為[18]：

(4)

式中：

s(Ar)——標準曲線峰面積比殘差；

a——標準曲線的斜率；

P——樣品溶液的測量次數(shù)；

N——標準溶液總測量次數(shù)；

c——樣品溶液EC質量濃度平均值，ng/mL；

2.2.4 樣品中加入內(nèi)標使用液體積Vyis的不確定度 內(nèi)標使用液體積100 μL的不確定為移液器測量重復性，ur(Vyis)=0.010。

2.2.5 樣品質量m的不確定度 樣品質量m=2.112 g，使用0.001 g電子天平。天平檢定合格，檢定證書顯示天平示值誤差E=0 mg，重復性m重=0 mg，則不確定度僅由天平分辯率d=0.001 g引入，質量稱量兩次，質量m的相對不確定度[12]：

2.2.6 回收率R引入的不確定度 采用樣品加標的方法測量樣品處理回收率。稱量2 g樣品，準確加入200 μL 0.515 μg/mL的EC中間液2，混勻后按1.3.2處理。回收率重復測量6次，結果見表4。

表4中，

表4 回收率測量結果Table 4 Result of recovery

(5)

(6)

平均回收率R的不確定度來源有回收率平均值的標準偏差和加標濃度兩部分[20]。

(1) 回收率平均值的標準偏差：

(2) 加標濃度引入的不確定度ur(c加)：根據(jù)式(4)，加標濃度的不確定度分量有EC中間液2 濃度、吸取體積、樣品質量3部分。因EC中間液2濃度不確定度包含在校準標準溶液中，不必重復評定，只需評定吸取體積、樣品質量的不確定度。

① 吸取體積200 μL，容量允差按均勻分布計算：

2.2.7 合成標準不確定度 不確定度分量中測量結果重復性urA、標準溶液濃度ur(cs)、曲線擬合ur(c)、樣品中加入內(nèi)標ur(Vyis)(此3項合成得樣品溶液濃度c的不確定度)、樣品質量ur(m)均認為相互獨立，合成得相對標準不確定度：

標準不確定度：uc=0.046 2×106=4.90 μg/kg。

標準不確定度主要來源見表5。

表5 標準不確定度來源Table 5 Source of standard uncertainty

2.3 擴展不確定度評定

取包含因子k=2，擴展不確定度U=k×uc=2×4.90=9.80≈10 μg/kg。

故白酒中氨基甲酸乙酯含量為(106±10) μg/kg，k=2。

2.4 影響因素分析

2.4.1 內(nèi)標液質量濃度 使用同一份內(nèi)標D5-EC使用液(2.00 μg/mL)，質量濃度及其不確定度與測量結果無關，因此在D5-EC標準品稱量、定容、稀釋等過程不必嚴格操作[8-9]，但在加入標準品、樣品中量取體積應準確。在計算中或色譜軟件中可直接以cD5=200 ng/mL計算。內(nèi)標選擇的原則是不得含有待測目標物，內(nèi)標濃度應使內(nèi)標信號強度適當，與目標物信號比例匹配。

2.4.2 定容體積 根據(jù)式(2)，混合溶液中質量濃度之比cs/cD5實際上是溶液中標準品與內(nèi)標質量之比，與定容體積無關，因此所有混合溶液中均無需評定定容體積的不確定度[9-10]。混標可直接在氣相用進樣瓶中配制，體積不必準確。

2.4.3 溫度 溫度影響體積。既有溫度不是定標溫度20 ℃ 的影響，也有溫度波動的影響；既有溶液體脹的影響，也有體積量器體脹系數(shù)的影響。玻璃量器體脹比溶液小得多，可忽略，但移液槍體脹系數(shù)不能忽略，特別是在混合標準溶液配制中需綜合評定溶液和移液槍的體脹、溫度對體積影響的不確定度。實際評定中，溫度引入的不確定度(配制EC儲備液及混標溫度貢獻僅占0.3%)較移液器體積允差(貢獻占10.0%)小得多，亦可忽略不計。因此當檢驗室溫度穩(wěn)定，沒有劇烈波動，試劑和溶液與檢驗室溫度平衡時，溫度引入的不確定度基本可以忽略。

2.4.4 回收率 同位素內(nèi)標物與目標物具有非常相似的物理化學性質，在樣品前處理或色譜響應上均表現(xiàn)出一致的特性，內(nèi)標法加標回收率與1(100%回收)之間不會存在顯著性差異[22]，從評定中也可發(fā)現(xiàn)加標回收率與1(100%回收)之間不存在顯著性差異，對大多數(shù)內(nèi)標法不必用樣品加標法檢驗回收率。

3 結論

同位素內(nèi)標法可自動校正進樣體積、混合溶液定容體積的偏差，加標回收率基本可達到100%，這使得同位素內(nèi)標法的重復性和準確性都要優(yōu)于外標法。經(jīng)評定，白酒中氨基甲酸乙酯測量結果為(106±10) μg/kg，k=2。主要的不確定度分量有：測量結果重復性(A類不確定度)、標準溶液濃度、曲線擬合及樣品加內(nèi)標液體積，其對測量不確定度的貢獻分別為60.8%，16.4%，18.0%，4.7%。其中，標準溶液濃度和樣品加內(nèi)標液不確定度主要來源于所用移液器體積誤差和重復性偏差，引入的不確定度合計貢獻19.4%，占比高達92%。因此在日常檢驗中要特別加強移液槍類的計量檢定和計量管理，盡量選用100 μL以上的體積，或者引用實際校準的容量誤差，以降低其引入的不確定度。其他來源如質量、玻璃量器、溫度等可忽略。可從增加平行樣品檢測次數(shù)、增加樣品溶液進樣次數(shù)以及減小曲線擬合的不確定度來提高檢測準確度。