食品中甲醛的穩定碳同位素特征分析及其在甲醛源解析中的應用

韓 莉 余婷婷 劉 迪 楊 青 高 芳 王會霞

(1.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430075; 2.湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，湖北 武漢 430075)

甲醛(Formaldehyde，FA)被廣泛用于醫療、衛生和農業等多個行業。甲醛暴露引發的人體健康風險持續被國際關注[1]。美國環境保護署規定每天攝入的量不超過0.2 mg/kg 體重[2]。2008年，中國衛生部印發的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》(食品整治辦[2008]3號)的通知中，明令禁止在食品中以任何形式添加甲醛，其限量規定為“不得檢出”。目前，由甲醛引起的食品安全事件仍屢見不鮮，在新近公布的食藥安全犯罪典型案例中，就有2起案例是非法使用工業用甲醛[3]。然而，監管實踐以及研究[4-6]發現許多食品存在一定量的內源性甲醛；水發水產品中甲醛平均值為50.35 mg/kg，海水魚類平均值為8.85 mg/kg，蝦蟹類、貝類、淡水魚中甲醛含量依次減少[7]。香菇引發的甲醛問題也引起了人們的廣泛關注，香菇甲醛是自身酶促反應的代謝產物[8]。日本農產品中干香菇和鮮香菇的甲醛含量分別為244，54 mg/kg，這些甲醛都是香菇生長、保鮮和干燥過程中自然產生。果蔬中的甲醛本底可達0.79～2.52 mg/kg[9]。小麥粉中甲醛的本底均值為3.85 mg/kg[10]。李薇霞等[6,11]研究發現，奶糖中主要物質奶粉中酪蛋白和乳糖的美拉德反應是奶糖中甲醛生成的主要原因。目前食品中甲醛的檢測方法如分光光度法[12-13]、氣相色譜法[14-15]、液相色譜法[16-18]和熒光法[19]等，主要以定量分析為主，難以識別食品中甲醛的來源。

相比“分子”尺度上的含量分析方法，單體穩定同位素分析技術(Compound-specific Stable Isotope Analysis,CSIA)在“原子”尺度上探尋物質的來源和相關的遷移、轉化規律，具有更為獨特的優點。利用不同來源物質中同位素豐度存在差異的原理，可甄別環境與食品中污染物來源。Marisa等[20]指出通過檢測葡萄酒中Pb的同位素比率可判斷鉛的污染源是自然污染還是土壤污染；通過測定食品中的13C值可以識別食品中多環芳烴和多氯聯苯的來源[21-22]。

由于甲醛分子具有強極性，在色譜柱上難以保留，測試靈敏度太低，大多數甲醛相關的檢測分析都是建立在甲醛衍生化后對甲醛衍生物的分析上[23-25]。碳同位素組成檢測過程中，對于檢測靈敏度不夠的有機物質，也可以對待測物進行衍生反應，衍生物的同位素組成可經質量作用定律從理論上計算出待測物的碳同位素組成[26-27]。余應新[28]利用GC/C/IRMS技術，采用2,4-二硝基苯肼柱衍生化并對衍生物的穩定碳同位素進行測定，間接得到了大氣甲醛的穩定同位素組成及特征，且衍生化過程不存在同位素分餾。文章擬驗證衍生化—氣相色譜—燃燒—同位素比質譜法測定食品中甲醛的穩定碳同位素組成的可行性，并用此方法分析水產品、果蔬、蔬菜制品3類典型食品中甲醛的穩定同位素組成及分布特征，通過模擬試驗分析內外源甲醛的貢獻率，驗證甲醛來源定量解析模型的可行性，為建立完善的食品安全溯源制度體系、食品中有毒有害物質的防控及食品安全監管提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醛水溶液、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、鹽酸、氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

超純水為實驗室自制一級水；

甲醛2,4-二硝基苯腙(FA-DNPH)標準品：純度為99.8%，美國CATO公司；

甲醛水溶液標準品：質量濃度為10 mg/L，中國First Standard公司；

同位素標準參考物質[乙醇溶液(δ13C=-26.72‰，BCR-660)，咖啡因(δ13C=-19.357‰，IAEA-600)]：國際原子能機構。

1.2 儀器與設備

氣體穩定同位素比值質譜儀：DeltaV型，美國賽默飛世爾科技公司；

氣相色譜儀：Trace GC Ultra型，美國賽默飛世爾科技公司；

元素分析儀：Flash 2000HT型，美國賽默飛世爾科技公司；

高效液相色譜儀：e2695型，美國Waters公司；

冷凍離心機：Allegra 64R型，美國貝克曼公司；

恒溫水浴搖床：WNE29型，德國memmert公司；

分析天平：ME204/02型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

超聲儀：S180H型，德國Elma公司；

氮吹儀：N-EVAP112型，美國Organomation Associates Inc公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

(1) 樣品制備：水產品、蔬菜制品、果蔬樣品切碎后研磨成泥或粉末，魷魚樣品分開內臟和其余肌肉部分，水產品和果蔬-20 ℃密封保存，蔬菜制品干燥密封常溫保存。衍生試劑2,4-二硝基苯肼用色譜純的乙腈重結晶兩次后用高效液相色譜檢驗其純度。將過量的純化后的DNPH溶于24 mL鹽酸，并定容至100 mL，配制成飽和的DNPH衍生溶液。

(2) 甲醛源解析模擬試驗：選取龍頭魚中含量較高的樣品進行外源性加標模擬試驗并測定其甲醛含量及δ13C值。本底測試：龍頭魚中4個平行批次；外源性甲醛加標測試：龍頭魚中3個水平的甲醛標準溶液加標，每個水平2平行；甲醛標準溶液測試：空白無基質樣品中4個水平的甲醛標準溶液加標，每個水平2平行。甲醛標準品配制成質量濃度為1.155 6 mg/mL的標準儲備液，龍頭魚中添加3個不同濃度水平(添加體積為30，150，200 μL)的標準儲備溶液。

(3) 衍生產物甲醛2,4-二硝基苯腙含量和δ13C值測定：準確稱取1～2 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 水，超聲提取30 min，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，使樣品及油脂和水充分分離，將上清液轉移至另一干凈離心管，加入1 mL DNPH衍生溶液(若樣品中FA含量過高，可增加衍生溶液的添加量至反應完全)，迅速蓋上蓋子，于60 ℃搖床衍生反應1 h，取出后迅速用流水冷卻，過0.22 μm濾膜，測定衍生物含量。向衍生后溶液中加入15 mL正己烷，翻轉搖勻充分萃取，4 ℃、4 000 r/min 離心3 min，取上層正己烷于50 mL離心管中，向殘留水溶液中再加入15 mL正己烷，重復萃取2～3次，合并正己烷層，將萃取液置于氮吹儀吹干，用甲醇定容至1 mL，通過GC/C/IRMS測定甲醛2,4-二硝基苯腙的穩定碳同位素值，以δ13CPDB值為-26.72‰的乙醇溶液矯正的CO2為內標，得到相對于箭石化石標準(PDB)的同位素組成。

(4) 衍生劑2,4-二硝基苯肼的δ13C值測定：稱取處理后的2,4-二硝基苯肼粉末0.1～2.0 mg，用錫杯包裹住粉末，置于自動進樣盤，通過元素分析—同位素比值質譜法(EA-IRMS)測定2,4-二硝基苯肼的穩定碳同位素值。以δ13CPDB值為-27.771‰的咖啡因矯正的CO2為內標，得到相對于PDB的同位素組成。

(5) 甲醛(FA)的δ13C值測定：5 mL樣品頂空瓶中吸取1 mL FA水溶液(37%)，加入2 g氯化鈉，65 ℃反應箱平衡90 min，用5 mL氣密性氣體進樣針抽取2 mL FA頂空氣體進樣，通過GC/C/IRMS測定FA水溶液中FA的δ13C值，以δ13CPDB值為-26.72‰的乙醇溶液矯正的CO2為內標，得到相對于PDB的同位素組成。

1.3.2 計算方法

(1) 甲醛的δ13C值：參照余應新等[28-29]的方法，按式(1)計算FA的穩定碳同位素比值。

fFAδ13CFA+fDNPHδ13CDNPH=δ13CFA-DNPH，

(1)

式中：

fFA、fDNPH——FA、DNPH在衍生物中的碳原子占比(fFA+fDNPH=1)。

(2) 外源性甲醛添加貢獻率：按式(2)計算人為添加甲醛的貢獻率，結合式(3)、式(4)得到人為添加貢獻率Xanthropogenic和δ13C值的關系式。

(2)

(3)

(4)

式中：

Xanthropogenic——人為添加甲醛對樣品甲醛的貢獻率；

1.4 數據處理

甲醛的穩定碳同位素組成數據由Isodat Acquisition采集軟件采集，Isodat Workspace定量分析軟件分析數據。甲醛的含量由Empower軟件采集并分析。數據匯總后通過Microsoft Office Excel進行相關計算處理。

2 結果與分析

2.1 液相衍生化過程同位素效應試驗結果

由表1可知，理論值和測定值最大偏差為0.344‰，可以認為甲醛的衍生化反應符合質量平衡方程。根據Rieley[30]提出的同位素效應理論，一個化學反應中同位素是否發生分餾，取決于決定反應速率的那一級反應是否存在與碳原子相連的化學鍵的斷裂和生成。DNPH在反應過程中沒有碳原子參與的化學鍵斷裂與生成，因此甲醛的衍生化反應沒有發生碳同位素分餾。

表1 液相衍生化過程結果表Table 1 Results of liquid phase derivatization process ‰

2.2 水產品中甲醛含量及其碳同位素組成

由表2可知，魷魚樣品中甲醛含量為0.341～24.185 mg/kg，δ13C值為-48.167‰～-24.514‰，龍頭魚中甲醛含量為54.555～121.416 mg/kg，δ13C值為-45.430‰～-27.468‰；日常監督抽檢的淡水魚中甲醛均為未檢出；龍頭魚中的甲醛含量遠高于魷魚，研究[31]表明，氧化三甲胺酶(TMAOase)存在于魷魚、鱈魚、甲殼類動物等水產品的內臟組織和肌肉中，這種酶的作用底物是氧化三甲胺(TMAO)，可催化使其分解產生二甲胺和甲醛(見圖1)。魷魚和龍頭魚中的氧化三甲胺酶對甲醛的生成起主要作用，氧化三甲胺可在酶的作用下分解成甲醛和二甲胺，因此海水魚中氧化三甲胺及酶的存在是其體內甲醛本底產生的主要原因，不同海水魚中酶的濃度、生存環境差異使得不同種類和地域的魚體內產生的甲醛含量不一，甲醛中穩定碳同位素組成也呈種類差異和地域差異；淡水魚中可能缺乏氧化三甲胺酶，不具備甲醛的生成條件，所以一般很少在淡水魚中檢出甲醛。

表2 水產品中甲醛含量及δ 13C值?Table 2 Formaldehyde mass fraction and δ 13C value in aquatic products

圖1 內源性甲醛生成途徑Figure 1 Formation pathway diagram of endogenous formaldehyde

由圖2可知，一般魷魚樣品的內臟部分甲醛含量高于肌肉部分，氧化三甲胺在酶的作用下轉化為甲醛過程可能主要在魷魚的內臟部分產生，繼而代謝至肌肉部分，1號魷魚樣品的肌肉部分甲醛含量高于內臟部分，可能是肌肉部分的魷魚除了來自于內臟自身代謝，還有一部分來自于外源性甲醛帶入。

由圖3可知，龍頭魚中肌肉部分的甲醛含量高于內臟部分。在對龍頭魚進行切分制樣過程中發現，龍頭魚的進食方式是直接大量吞食小魚，內臟中有大量未經消化完全的小魚殘渣，而內臟部分的制樣是采取全部內臟混勻均質制樣，這些小魚占內臟的質量比重較高，使得內臟部分甲醛含量偏低。

各樣品種甲醛含量測量值的RSD均<10%圖2 魷魚中甲醛含量示意圖Figure 2 Schematic diagram of formaldehyde mass fraction in squid

各樣品中甲醛含量測量值的RSD均<10%圖3 龍頭魚中甲醛含量示意圖Figure 3 Schematic diagram of formaldehyde mass fraction in dragon fish

為探究水產品貯藏過程中甲醛含量及穩定碳同位素比值的變化，30 d后再次對甲醛含量較高的魷魚樣品1～5號和龍頭魚樣品1～6號進行甲醛含量和δ13C值測定，結果如圖4所示。由圖4可知，魷魚和龍頭魚的甲醛含量在30 d后均大量提高，其含量最高分別增加了35.956，224.416 mg/kg，且甲醛的δ13C 值也隨之逐漸偏負，說明貯藏過程中，魷魚和龍頭魚體內的氧化三甲胺在酶的作用下反應活躍，甲醛不斷產生，酶促反應中，氧化三甲胺轉化而來的甲醛中碳原子偏輕，導致魷魚、龍頭魚中甲醛的穩定碳同位素比值逐漸偏負。

2.3 蔬菜制品中甲醛含量及其碳同位素組成

選取日常監督抽檢中常有的蔬菜制品類別如干香菇、黃花菜、茶樹菇、木耳、銀耳進行甲醛含量測定，不同種類蔬菜制品中甲醛含量如圖5所示。由圖5可知，干香菇中甲醛含量普遍較高，最高可達212.741 mg/kg；黃花菜中甲醛未檢出；茶樹菇、木耳、銀耳中甲醛均有檢出，但含量較低，不超過3 mg/kg。香菇在生長和貯藏過程中，香菇體內的γ-谷氨酰轉肽酶和半胱氨酸亞砜裂解酶可將香菇酸(γ-谷氨酰半胱氨酸亞砜)轉化成甲醛，因此香菇本體會產生大量的內源性甲醛，并且隨著貯藏時間的加長其含量不斷增加(見表3)，香菇中甲醛的δ13C值在90 d后逐漸偏正，可能在γ-谷氨酰轉肽酶和半胱氨酸亞砜裂解酶作用下，香菇酸中更多13C原子轉化為甲醛。

表3 貯藏期香菇干制品甲醛含量變化Table 3 Changes of formaldehyde mass fraction in dried lentinus edodes products during storage

1～5.魷魚樣品 6～11.龍頭魚樣品各樣品種甲醛含量測量值RSD均<10%，δ 13C值測量值SD均<0.5‰圖4 貯藏過程中甲醛含量及碳同位素比值變化示意圖Figure 4 Schematic diagram of the change of formaldehyde mass fraction and carbon isotope ratio during storage

各樣品種甲醛含量測量值RSD均<10%，δ 13C值測量值SD均<0.5‰圖5 蔬菜制品中甲醛含量示意圖Figure 5 Schematic diagram of formaldehyde mass fraction in vegetable products

2.4 果蔬中甲醛含量及其碳同位素組成

對關注度較高的一些果蔬進行分析，結果如圖6所示。由圖6可知，果蔬中檢出的甲醛含量較低，蘋果中含量最高為2.478 mg/kg，鮮香菇中甲醛含量較高，高達38.036 mg/kg，但低于干香菇，因為干香菇中水分少，一般貯藏時間長，甲醛殘留量較高。

2.5 食品中甲醛源解析模擬試驗及定量源解析模型分析

2.5.1 食品中甲醛來源分析模擬批試驗及結果 選取龍頭魚中含量較高的樣品進行外源性加標模擬試驗并測定其甲醛含量及δ13C值，模擬試驗結果如表4所示。由表4 可知，龍頭魚中添加3個不同濃度水平的標準儲備溶液，加標回收率均>90%，無基質空白中添加4個不同濃度水平的標準儲備溶液，加標回收率均>90%，不同濃度的空白加標樣品中甲醛δ13C值標準偏差<0.5‰，甲醛含量對穩定碳同位素測試的影響較小。外源性甲醛標準品的δ13C值比龍頭魚偏正，向龍頭魚中添加外源甲醛會使龍頭魚樣品中甲醛的δ13C值偏正，且添加量越大，δ13C值偏正越多。

各樣品甲醛含量測量值RSD均<10%圖6 果蔬中甲醛含量示意圖Figure 6 Schematic diagram of formaldehyde mass fraction in fruits and vegetables

表4 龍頭魚中外源性甲醛加標模擬試驗結果Table 4 Simulation test results of exogenous formaldehyde in dragon fish

2.5.2 甲醛來源定量解析模型適用性分析 分別在龍頭魚樣品中加入3個濃度水平的外源性甲醛，其外源性甲醛貢獻率的理論值、測定值和由式(4)計算得到的計算值如圖7所示。由圖7可知，通過測定濃度得到的外源甲醛貢獻率測定值和理論值差異較小，由定量解析模型分析計算得到的人為添加外源甲醛貢獻率計算值比理論貢獻率偏大，甲醛添加量較低時，計算值與理論值偏差較大；甲醛添加量較高時，計算值與理論值相對標準偏差<15%。總體而言，通過甲醛來源定量分析模型來分析單一的外源性甲醛添加貢獻是可行的，但是如果實際樣品中外源性甲醛來源有多種，單純的定量分析模型難以對不同來源的甲醛進行準確的定量計算，還需綜合分析各來源甲醛的穩定碳同位素特征。

圖7 外源性甲醛貢獻率示意圖Figure 7 Schematic diagram of exogenous formaldehyde contribution rate

3 結論

衍生化—氣相色譜—燃燒—同位素比質譜法間接測定食品中甲醛的方法是可行的。水產品中甲醛含量為龍頭魚>魷魚>淡水魚，淡水魚中甲醛未檢出，其含量差異可能與水產品中氧化三甲胺酶存在與否和濃度高低有關，龍頭魚和魷魚中甲醛的δ13C值均在貯藏30 d后越來越負。蔬菜制品中干香菇中甲醛含量較高，其δ13C值隨貯藏時間的延長逐漸偏正，與水產品相反。這與香菇和水產品中不同的反應基質和酶有關，香菇中的酶促反應可能更傾向于將偏正的13C原子轉化為甲醛。新鮮果蔬食品中甲醛含量較低，鮮香菇的甲醛含量較高，但遠低于干香菇，鮮、干香菇的含量差異可能與水分含量、貯藏條件和時間有關。甲醛標準溶液中甲醛的δ13C值比龍頭魚偏正，因此向龍頭魚中添加甲醛標準溶液會使其δ13C值偏正，不同加標水平下測得的甲醛δ13C值及其貢獻率符合甲醛來源定量分析模型，該模型可用于單一來源外源添加甲醛的食品中貢獻率的分析計算。若外源性甲醛途徑較多，則需結合多種來源甲醛的穩定碳同位素特征進行綜合分析。后期需要建立食品中不同來源甲醛穩定碳同位素組成特征數據庫，為食品中甲醛來源甄別解析提供科學依據。