腸桿菌發酵對煙草浸膏化學成分及卷煙品質的影響

葉建斌 齊曉娜 楊宗燦 張婷婷 馮穎杰

(1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；2.河南中煙工業有限責任公司技術中心，河南 鄭州 450000)

煙草浸膏是卷煙重要的香料，可以改善煙草吸食品質[1-2]。目前用于煙草浸膏提取的方法有溶劑萃取[3]、分子蒸餾[4]、亞臨界萃取[5]及超臨界萃取[6]等物理化學方法，利用生物酶或微生物發酵等生物技術制備煙草浸膏的研究報道也越來越多[7-10]。由于物理或化學法獲得的煙草浸膏存在煙葉原料制約、操作過程復雜或有機溶劑使用過度等缺點，因此在推廣應用上還受到一定的限制。生物酶法，由于酶制備的成本較高，限制了其在煙草浸膏制備中的推廣應用。而微生物發酵法，反應條件溫和，可以有效利用浸提液中一些大分子物質作為碳源或氮源，在生成香味物質的同時可以減少雜氣，合成的香料味道更接近煙草本香。一些基于生物發酵的合成香料在卷煙加香中表現出了良好的效果。王娜等[11]曾采用產香酵母菌處理煙葉碎片，通過對發酵工藝優化，制備獲得了一種煙草浸膏，但發酵時間達到14 d。

受限于細菌對高糖濃度不耐受以及對煙堿等煙草特征物質的敏感性，利用細菌發酵制備特征性煙草浸膏的報道目前還較少。因此，如何獲得可耐受高濃度糖和煙堿的細菌是制備具有特征香味煙草浸膏的關鍵之一。實驗室[12]前期從煙草表面分離獲得了一株腸桿菌，經過高濃度糖和煙堿的煙草濃縮液馴化后，該菌能在煙草浸提液中降解煙草大分子物質并產生特征性的香味物質。研究擬利用該微生物對煙草浸提液進行發酵，考察該微生物發酵對煙草浸提液中大分子物質、氨基酸等化學成分的影響，并分析發酵后制得煙草浸膏中的香味成分及其應用于卷煙后對煙氣香味成分的影響，以期制備一種特色的甜香型煙草浸膏。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 菌種與培養基

腸桿菌：實驗室保存；

種子培養基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，去離子水定容至1 L，pH 7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.2 煙末、煙絲、卷煙

煙末、煙絲：黃金葉生產制造中心；

參比卷煙：紅旗渠品牌，黃金葉生產制造中心。

1.1.3 試劑

二氯甲烷：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；

乙酸苯乙酯：標準品，北京百靈威科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，天津市富宇精細化工有限公司；

磷酸氫二鈉：分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；

無水硫酸鈉：分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；

乙酸、聚乙氧基月桂醚、酒石酸鉀鈉、硫酸鉀、水楊酸鈉：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.4 儀器

連續流動分析儀：AutoAnalyzer3型，德國布朗盧比公司；

氣相色譜—質譜聯用儀：6890-5973型，美國Agilent公司；

旋轉蒸發器：EYELA(N-1100)型，上海亞榮生化儀器廠；

高效液相色譜儀：1260 Infinity ELSD型，安捷倫科技有限公司；

生化培養箱：SHP-150型，上海森信實驗儀器有限公司；

紫外—可見分光光計：UV-2300型，北京普析通用有限責任公司；

超聲波清洗機：SB25-12D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：YM50-Z型，濟南來寶醫療器械有限公司；

高速離心機：Hicen FR型，德國英雄實驗儀器公司；

恒溫恒濕箱：KBF240型，德國Binder公司；

20孔道吸煙機：RM20HRM20H型，德國BORGWALDT-KC公司。

1.2 方法

1.2.1 腸桿菌種子制備 將腸桿菌菌株的單菌落接種到5 mL種子液培養基中，置于30 ℃，150 r/min的搖床進行培養，反應至菌液OD600 nm值為2.0～2.5時，得到種子液，用于后續發酵。

1.2.2 煙草浸膏制備 煙絲按固液比(m煙絲∶V水)1∶10 (g/mL) 于55 ℃下浸提2 h，過濾，取煙草浸提液，115 ℃ 滅菌20 min，按體積分數2%將腸桿菌種子液接種到煙草浸提液中，37 ℃發酵培養3 d，獲得發酵浸提液，6 000 r/min 離心10 min，上清液于70 ℃真空濃縮至密度為(1.200±0.005) g/cm，加入90%乙醇后于-20 ℃沉降24 h，6 000 r/min離心10 min，取上清液，45 ℃下真空濃縮至密度為(1.200±0.005) g/cm，得煙草浸膏。

1.2.3 化學成分分析

(1) 蛋白質含量：按YC/T 249—2008《煙草及煙草制品 蛋白質的測定 連續流動法》執行。

(2) 淀粉含量：按YC/T 216—2007《煙草及煙草制品 淀粉的測定 連續流動法》執行。

(3) 果膠含量：按YC/T 346—2010《煙草及煙草制品 果膠的測定 離子色譜法》執行。

(4) 總糖含量：按YC/T 159—2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續流動法》執行。

(5) 還原糖含量：按YC/T 159—2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續流動法》執行。

(6) 總植物堿含量：按YC/T 160—2002《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續流動法》執行。

(7) 氨基酸含量：按YC/T 282—2009《煙葉 游離氨基酸的測定 氨基酸分析儀法》執行。

1.2.4 香味成分分析

(1) 前處理：取1 g發酵后的煙草浸膏加入10 mL二氯甲烷中，并加入一定濃度的乙酸苯乙酯作為內標，常溫震蕩混合1 h，靜置后倒入分液漏斗，取有機相。重復萃取5次，合并有機相，在水浴溫度為55 ℃、體系壓力為18.0 kPa下旋蒸濃縮至體積為1 mL。

(2) GC-MS分析條件：采用DB-5MS(50 m×0.25 mm×0.25 μm)柱；進樣溫度250 ℃；分流比5∶1；延遲5 min；載氣(He)流速1 mL/min；升溫程序：50 ℃保持1 min，以5 ℃/min 升至250 ℃保持5 min；傳輸線溫度270 ℃；EI離子源；電子能量70 eV；掃描范圍35～600 amu。NIST11譜庫進行檢索，并結合標準質譜峰面積確定香味成分，以乙酸苯乙酯為內標進行定量分析，根據濃縮后體積計算各香味成分在煙草浸膏中的含量。

1.2.5 煙氣香味物質分析 卷煙煙氣粒相組分的種類和結構很復雜，其中主要香味物質包括萜類化合物、羰基化合物(醛、酮類化合物)、氮雜環化合物、酚類化合物、有機酸等[13-14]。參比卷煙為黃金葉(硬紅旗渠)未加香加料卷煙(T0)，加入未經發酵煙草浸膏(其余步驟和條件與腸桿菌發酵后的煙草浸膏的制備方法完全相同)的卷煙作為對照(T1)，加入發酵煙草浸膏的卷煙為試驗組(T2)。煙草浸膏添加量為300 mg/kg(按照卷煙煙絲重量0.6 g)，煙草浸膏添加完成后于溫度22 ℃、濕度65%環境中平衡48 h。

平衡水分之后取出，用吸煙機進行抽吸。卷煙抽吸完畢后，迅速取出劍橋濾片，放入錐形瓶中，加入50 mL萃取溶劑(以乙酸苯乙酯為內標，濃度為1.032 mg/mL)，搖勻，常溫超聲萃取30 min(超聲功率70 W，超聲頻率40 kHz)，靜置5 min，取出上清液。再次加入50 mL萃取溶劑，重復上述萃取步驟。然后合并上清液，旋蒸濃縮至1 mL，用GC-MS進行香味成分檢測。GC-MS分析條件同1.2.4。

1.2.6 感官評價 以未加任何香料的卷煙為空白(K0)，加入未經發酵煙草浸膏的卷煙作為對照(K1)，加入發酵煙草浸膏的卷煙為試驗組(K2)。煙草浸膏添加量為50 mg/kg，與煙絲混勻后于溫度22 ℃、濕度65%環境中平衡48 h，卷制成卷煙，經由7人組成的專業評吸小組對添加效果進行感官評價。

2 結果與分析

2.1 浸提液大分子物質在發酵過程中的變化

發酵前后煙草浸提液大分子物質含量變化見表1。發酵后，浸提液中大分子物質均有所降低。其中總糖、還原糖含量與發酵前相比下降顯著，分別降低了49.51%，55.81%。蛋白質、淀粉、半乳糖醛酸、總植物堿含量與發酵前相比均有所降低，分別降低了28.95%，19.44%，18.91%，3.71%。研究結果表明，經腸桿菌發酵后所得到的特色煙草浸膏與未經處理的普通煙草浸膏相比，大分子物質含量均有所下降。雖然淀粉會部分水解為單糖，但在發酵過程中，煙草浸提液中的微生物會消耗還原糖[15]，從而導致總糖和還原糖濃度有大幅度的降低。半乳糖醛酸作為果膠質的重要組成成分，在發酵過程中也有部分被水解[16]。發酵過程中，蛋白質也會隨著微生物的生長而被消耗，因此發酵后蛋白質含量出現一定程度的降低。

表1 發酵前后浸提液大分子物質質量濃度變化Table 1 Changes of mass concentration of macromolecules in the extract before and after fermentation

2.2 浸提液氨基酸含量在發酵過程中的變化

對煙草浸提液發酵前后主要氨基酸含量進行檢測，結果見表2。浸提液發酵后，氨基酸總含量減少了37.45%，但有部分氨基酸含量增加。

脯氨酸、天冬酰胺、4-氨基丁酸、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、甘氨酸含量均降低。其中天冬酰胺含量降低最為顯著，降低了94.47%。纈氨酸、胱氨酸、精氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、賴氨酸含量均增加。其中異亮氨酸含量增加最為顯著，增加了161.26%。氨基酸總含量減少的原因可能包括：① 氨基酸與還原糖發生美拉德反應。比如脯氨酸與葡萄糖反應生成1-脫氧-1-(L-脯氨酰基)-D-果糖，丙氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸等與葡萄糖和果糖反應生成其他Amadori化合物；② 煙草浸提物自身富含大量微生物，氨基酸作為微生物生長代謝的主要氮源物質，發酵過程中被微生物作為氮源消耗掉；③ 氨基酸進一步分解變化。氨基酸脫氨基產生有機酸和氨，而氨可以與有機酸結合生成新的氨基酸，這也解釋了發酵后各氨基酸含量有的增加、有的減少的現象。

2.3 煙草浸膏香味成分分析

未發酵煙草浸膏有31種香味成分，經腸桿菌發酵的煙草浸膏有42種香味成分。經腸桿菌發酵后，煙草浸膏香味物質含量由334.19 μg/g增加到486.98 μg/g(表3)。

表3 煙草浸膏發酵前后主要香味成分變化?Table 3 Changes of aroma components of tobacco extract before and after fermentation

與未發酵煙草浸膏相比，大部分醇類和酮類香味物質含量都有所增加。糠醇、3-甲基-2-環戊烯-1-酮、麥芽酚、5-甲基糠醛在發酵后含量分別提高了175.00%，207.36%，194.41%，48.07%。這4種物質是烤甜香味主要標志性成分[17]，具有甜的焦糖樣香韻，其甜香味能與煙草香味諧和。苯甲醇、α-苯乙醇、金合歡醇含量在發酵后分別達到3.86，7.70，2.57 μg/g。苯甲醇會產生令人愉快的甜味芳香和果味芳香；α-苯乙醇具有蜂蜜的香氣和水果的味道；金合歡醇具有溫和新鮮青香，味道很甜。茄酮、β-大馬酮、巨豆三烯酮等煙草特征香味物質含量都有所增加，發酵后含量分別為31.54，15.82，34.95 μg/g。茄酮具有新鮮胡蘿卜樣的香味；β-大馬酮具有濃而甜潤的花香；巨豆三烯酮有甜潤而又持久的煙草樣香氣和干果香氣，是煙草中重要的香味成分[18]101-110,199-200。上述香味成分含量的增加賦予了發酵浸膏一種清甜香風味，可明顯提高其嗅香。

前期研究[19]證實腸桿菌可降解煙草葉黃素，降解產物是8-甲基-α-紫羅蘭酮和3-羥基-α-紫羅蘭酮，其次還有少量的3-氧化-α-紫羅蘭酮。發酵后樣品中檢測到新增8-甲基-α-紫羅蘭酮，并賦予發酵浸膏一種花香和清香感，在卷煙中應用有望改善協調性，豐富卷煙的香氣。另外，發酵后還新增了一些酯類和酚類香味物質，如：γ-丁內酯、乙酸對甲酚酯、鄰苯二酚、4-甲氧甲基苯酚、2，5-二叔丁基苯酚。

2.4 卷煙煙氣香味成分檢測

將上述制備的不同浸膏應用于卷煙，并對卷煙煙氣經GC-MS分析后，比較應用效果。煙氣中釋放量較大的香味物質主要包括醇類、酮類、醛類、酸類、酚類、酯類以及一些其他煙草香味物質，詳見表4。

由表4可知，T0(空白卷煙)、T1(添加未發酵浸膏)、T2(添加發酵浸膏)的香味物質總含量分別為140.55，183.83，222.97 μg/g。與T0相比，T1、T2的香味物質種類和含量都有所增加。其中植物醇、金合歡醇、β-紫羅蘭醇、糠醇、糠醛、檸檬醛、茄酮、β-紫羅蘭酮、2,3-丁二酮、4,7,9-巨豆三烯-3-酮等醇、酮類香味物質在添加煙草浸膏后含量均得到了明顯提高。T2的植物醇、金合歡醇、β-紫羅蘭醇、糠醇含量分別達32.87，3.74，1.21，0.58 μg/g，含量均高于T0、T1。植物醇常作為定香劑用于煙用香精；金合歡醇和糠醇具有甜香氣息；β-紫羅蘭醇具有強烈的紫羅蘭香氣和甜的香味。這些香味物質都可以增加卷煙甜香香韻，使煙氣吸味更加柔和醇厚。與T1相比，T2的糠醛、檸檬醛、β-紫羅蘭酮、2,3-丁二酮的含量分別增加了10.95%，53.07%，48.72%，55.07%。糠醛具有甜的、焦糖的香韻；檸檬醛具有強烈的檸檬樣香氣，有一種特有的苦甜味道；β-紫羅蘭酮具有顯著的水果香和木香香氣；2,3-丁二酮則具有奶香氣息，是奶油香精的主要香料[18]162,183-202。這些特征性香味成分在煙氣中的增加與發酵浸膏中該類香味物質含量的增加具有一致性，證實浸膏可作為香料應用于卷煙，能夠提高卷煙香氣的質和量。

表4 各卷煙煙氣主要香味成分檢測結果?Table 4 Detection results of aroma substances in cigarette smoke

另外，一些酚類物質如苯酚、對甲酚、愈創木酚、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、4-乙基苯酚含量均是T2>T1>T0，這些酚類物質都可用于煙用香料。酯類物質中乙酸丁酯具有強烈的水果香氣，呈先辣后甜的味道，在煙草中用于增強水果風味，但由于其易揮發，向煙氣的轉移率小，故含量較低。辛酸甲酯具有強烈的酒香、果香和甜橙香氣，且持久性好，在煙草制品中能加強煙香煙味的濃度，香氣與烤煙諧和[18]262,355。

總的來說，煙草浸膏是卷煙重要的香原料，添加一定量的煙草浸膏后，卷煙煙氣的香味成分增多，主體香氣得以提高，賦予卷煙更為自然、飽滿的香氣量。與未發酵的煙草浸膏相比，腸桿菌發酵后得到的煙草浸膏香味物質含量更高、甜香風味更加明顯，在卷煙中應用，這種甜香風格可以轉移到煙氣中，從而顯著提高煙氣的香氣質。

2.5 卷煙感官評價

由表5可知，加入發酵煙草浸膏的卷煙(K2)較未加煙草浸膏的卷煙(K0)和加入未發酵煙草浸膏的卷煙(K1)，雜氣減輕，潤感提升，刺激減小，回甜、余味均有提高。同時，由于腸桿菌發酵后產生了一些新的香氣物質，使得卷煙香氣的質和量也增加明顯，能顯著改善吸味和余味，提高卷煙內在品質。

表5 不同處理后卷煙感官評吸結果Table 5 Average value of cigarette smoking evaluation results

3 結論

試驗利用腸桿菌發酵煙草浸提液制備了一種具有甜香風格的優質煙草浸膏。通過微生物發酵煙草浸提液可以有效減少底物中的蛋白、植物堿等大分子物質。腸桿菌本身發酵可產生紫羅蘭香味成分，同時發酵后浸提液中參與美拉德反應的氨基酸種類和含量增加會提高后續制備浸膏的香味物質，這賦予了浸膏一種甜香風格的特征。另外，研究證明發酵浸膏中含有甜香風格的香味成分可以在卷煙中應用，并通過熱轉移直接進入卷煙煙氣中，從而提高煙氣的香氣質和香氣量。研究雖得出了發酵前后大分子物質和氨基酸含量的變化，但未追蹤發酵過程中的動態變化，后續重點通過對發酵過程化學成分變化進行監控，進一步確定煙草浸膏物質組成對其風格特征的影響。