傳統泡菜中兩株耐酸性乳酸菌的分離與鑒定

馮金曉 李明珠 李翠萍 燕文迪

(青島工學院食品工程學院，山東 青島 266300)

乳酸菌作為一類典型的益生菌群，具有調節腸道菌群、促進腸道消化吸收[1-2]、降低血清膽固醇[3-4]、抗氧化[5]等作用，還能減輕體重、調節體脂[6]、改善糖尿病[7]等慢性疾病及抑郁癥[8]、老年癡呆[9]等精神性疾病。人體攝入的乳酸菌需經過胃部并定殖于腸道壁上才能發揮其生理活性，但胃部高酸環境會使乳酸菌活性大幅降低。孟祥晨等[10]研究表明在pH 1.5的環境條件下作用3 h后，短雙歧桿菌存活率僅為0.05‰。其原因可能是胃部高酸環境改變了乳酸菌細胞膜所帶的電荷及細胞蛋白機構，從而使乳酸菌活性下降[11]；另外人體消化系統分泌的胃液、膽汁、胰液等對乳酸菌的活性也有一定影響[12-13]。李洋等[14]從青海地區的牦牛酸乳中分離得到6株在pH 3.0條件下存活的乳酸菌；呂源玲[15]從嬰兒糞便中篩選出3株對pH 3.5的酸性條件具有一定耐受能力的乳酸菌。篩選耐胃酸性乳酸菌，對乳酸菌順利通過胃部進入人體腸道，并充分發揮益生作用具有重要意義。

泡菜是以乳酸菌進行厭氧發酵的一類傳統發酵食品[16]，富含乳酸菌[17-18]，在中國有著悠久的歷史。試驗擬以泡菜為研究對象，采用傳統分離培養技術對其中的乳酸菌進行分離，并模擬胃酸條件篩選出耐胃酸能力較強的菌株，采用16S rDNA測序技術對其進行鑒定以確定種屬。旨在為耐胃酸性菌株應用于食品加工，充分發揮其生理功效提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

吉林的家腌酸菜：吉林白山市撫松縣天池圣景農貿市場；

山東的腌蘿卜：山東青島市膠州西路農貿市場；

山東的糖蒜：山東菏澤銀田農貿城；

成都的家腌混合泡菜：成都農產品中心批發市場；

貴州的酸菜及酸蘿卜：貴州盤州市杜鵑路菜市場；

營養培養基、MRS固體培養基：青島海博生物技術有限公司；

過氧化氫酶：2.0×104U/mg，廣東環凱微生物科技有限公司；

牛肉浸膏、蛋白胨、瓊脂、明膠、木糖、果糖、半乳糖：生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司；

吲哚試劑、甲基紅、檸檬酸三鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫銨、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈉、硫代硫酸鈉、葡萄糖：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

乳酸菌成套生化鑒定管：生化試劑，青島海博生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備

高壓滅菌鍋：BKQ-B7511型，山東博科生物產業有限公司；

恒溫培養箱：DH4000BII型，天津市泰斯特儀器有限公司；

凈化工作臺：SW-CJ-1D型，蘇州凈化設備有限公司；

顯微鏡：CX31型，寧波天宇光電科技有限公司；

二氧化碳厭氧培養箱：WJ-3-160型，上海躍進醫療器械有限公司；

高速冷凍離心機：H1650-W型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物分離純化

(1) 樣品稀釋：用移液槍分別吸取1 mL樣品汁液于9 mL無菌生理鹽水試管中，經渦旋振蕩器混勻后制成10-1泡菜樣品稀釋液；按照梯度稀釋法依次將泡菜樣品稀釋至10-2，10-3，10-4。

(2) 分離培養：無菌條件下用移液槍分別移取0.2 mL 樣品稀釋液涂布于MRS固體培養基中，倒置于37 ℃二氧化碳厭氧箱中培養36～48 h。

(3) 純化培養：根據菌落的生長情況，挑選菌落形態不同的微生物進行劃線純化，于37 ℃條件下恒溫培養48 h，選取培養后的菌株進行純度檢驗，將混合菌株繼續劃線分離純化，直至平板內為單一菌落。

1.2.2 菌株的初步鑒定

(1) 菌落形態特征觀察：觀察純化后固體平板中微生物菌落形態(菌落顏色、邊緣整齊度、表面光滑度、透明度、濕潤度等)[19]。

(2) 菌體形態特征觀察：革蘭氏染色法。

(3) 生理生化試驗：產過氧化氫酶試驗、運動性試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗、檸檬酸鹽分解試驗、硫化氫試驗、淀粉水解試驗、糖(麥芽糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖等)發酵試驗[20][21]370-379。

1.2.3 乳酸菌定性試驗 將10%的硫酸與2%的高錳酸鉀按V硫酸∶V高錳酸鉀=1∶1混合后滴入菌種發酵液中，將含硝酸銀溶液的濾紙條搭于試管口，加熱試管，發酵液中若有乳酸生成則與硫酸和高錳酸鉀反應生成乙醛，加熱后的乙醛蒸氣在管口處遇硝酸銀會使試紙變黑。

1.2.4 乳酸菌耐酸性試驗 將乳酸菌用營養培養基增菌培養48 h后，用8 000 r/min高速冷凍離心機離心15 min，將沉淀物菌體用無菌生理鹽水洗滌并稀釋定容至10 mL，分別吸取1 mL菌液至9 mL模擬胃液中(另取1 mL菌液至9 mL蒸餾水中對照)，37 ℃恒溫振蕩處理2.0 h，平板涂布計數，按式(1)計算耐酸性乳酸菌存活率[22]。

(1)

式中：

S——存活率，%；

N1——胃酸處理后的活菌數，CFU/mL；

N2——胃酸處理前的活菌數，CFU/mL。

1.2.5 乳酸菌16S rDNA基因序列測定及同源性分析

使用引物序列27F：AGAGTTTGATCCTGGCTC-AG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT進行PCR擴增，測序由上海美吉生物工程有限公司完成。將基因序列在NCBI上通過BLAST進行比較分析，利用CLUSTAL X軟件和MEGA3.1軟件進行多序列比對及構建目標菌株與參比菌株之間的系統進化樹[23]。

1.3 數據處理

測序結果利用CLUSTAL X軟件和MEGA3.1軟件對菌株的序列進行親緣性分析。

2 結果與分析

2.1 微生物的分離純化

將4個地區的6個泡菜樣品稀釋后，取10-2，10-3，10-4稀釋液0.2 mL涂布于MRS瓊脂平板培養基中，37 ℃ 厭氧培養48 h，挑取不同菌落形態的菌落采用劃線法分離純化，觀察菌落形態結果如圖1所示。將分離純化得到的菌落從形狀、光滑度、黏稠度、菌落顏色、透明度、表面凸起等方面對菌落進行形態學描述，結果如表1所示。對8株菌進行革蘭氏染色觀察菌體形態，結果如圖2所示。

表1 微生物菌落形態特征Table 1 Morphological characteristics of microbial colonies

圖1 微生物初步分離菌落形態特征Figure 1 Morphological characteristics of colonies isolated from microorganisms

由圖2可知，8株菌均為革蘭氏陽性菌，菌體呈長桿或短桿狀，排列方式為單個和短鏈排列、長鏈排列或分散排列，根據伯杰細菌鑒定手冊[21]289可知這8株菌符合乳酸菌的形態特征。

圖2 8株微生物菌體形態圖Figure 2 Morphology of 8 strains of microorganisms

2.2 乳酸菌菌株的生理生化鑒定

對分離得到的8株菌進行生理生化鑒定，結果如表2所示。

根據形態學觀察結合表2生理生化試驗結果，對照伯杰細菌學鑒定手冊[21]290-294，8株菌符合乳酸菌相關特征，需結合乳酸菌定性試驗及分子生物學進一步確定。

表2 8株細菌生理生化試驗結果?Table 2 Physiological and biochemical test results of 8 strains of bacteria

2.3 乳酸菌定性試驗結果

吸取各菌種發酵液10 mL，分別加入1 mL H2SO4溶液和KMnO4溶液，加熱發酵液至沸騰后，取濕潤的含氨硝酸銀溶液濾紙條橫搭在試管口上，觀察濾紙顏色變化，結果如表3所示。

由表3可知，測試東北HS、山東SRB、貴州LB菌株的濾紙變為黑色，說明這3株菌在培養過程中能夠代謝產生乳酸，具備乳酸菌發酵糖產生乳酸的特性。

表3 乳酸菌定性試驗結果Table 3 Qualitative experiment of lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌耐酸性試驗結果

將菌種接種于pH 2.5的模擬胃液中37 ℃恒溫震蕩處理2.0 h，接種至MRS固體培養基中培養計數，結果如表4所示。

由表4可知，經過pH 2.5模擬胃酸性試驗山東SRB菌、東北HS菌的存活率超過10%，說明這兩株菌具有較強的耐受高酸性環境能力，具備通過胃部達到腸道的條件。試驗結果與其他研究結果較為一致，如：李洋等[14]對牦牛酸乳中乳酸菌的耐酸性能進行了研究，結果表明在pH 3.0的酸性條件下處理3 h后，有8株菌的存活率高于13%。試驗中貴州LB存活率低于2%，耐受高酸性能力相對較差，即使能通過胃部環境，但存活數量較少，繼續發揮生理功能效果不明顯。因此將耐胃酸能力較強的山東SRB菌、東北HS菌進行分子生物學鑒定。

表4 乳酸菌耐酸性試驗結果Table 4 Acid resistance test of lactic acid bacteria

2.5 乳酸菌16S rDNA基因序列測定及同源性分析

使用通用引物擴增后，進行電泳檢測。電泳條件：1%瓊脂糖凝膠，120 V電壓電泳30 min。結果如圖3所示，耐酸性較強的兩株菌在1 500 bp處出現特異清晰的條帶，且產物條帶單一，滿足測序要求。

圖3 PCR產物檢測電泳圖Figure 3 Electrophoresis of PCR products

測序后利用BLAST將2株菌的基因片段序列與GenBank/NT數據庫中已知序列進行比對，獲得近源物種信息。利用CLUSTAL X軟件和MEGA3.1軟件構建系統進化樹，菌株HS與MT512165.1Lactobacillusbrevisstrain 3379親緣性最近，菌株SRB與MT604606.1Lactobacillusparacaseistrain 2013親緣性最近，結果如圖4所示。菌株的16S rDNA序列比對結果確定東北HS為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、山東SRB為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)。

圖4 兩株菌基因序列系統發育樹Figure 4 Phylogenetic tree of gene sequences of the two strains

3 結論

試驗從6個泡菜樣品中分離純化得到8株菌，經形態學觀察、生理生化試驗、乳酸菌定性試驗及耐胃酸模擬試驗，篩選得到2株耐酸性較強的菌株，經分子生物學鑒定及同源性分析可知，兩株菌分別為編號為東北HS的短乳桿菌和編號為山東SRB的干酪乳桿菌。

乳酸菌具有耐受胃酸能力，可保障其通過胃部高酸環境并保持活性，但還需在腸道壁上定殖并達到一定數量后才能充分發揮其生理功效。研究篩選得到的乳酸菌，具有耐受高酸性能力，來自于傳統泡菜，但能否應用于食品生產，還需從以下幾個方面進行更加深入的研究：首先，篩選得到的乳酸菌能否與腸黏膜上皮細胞相互作用順利定殖于腸道壁上需要進一步研究；其次，篩選得到的乳酸菌需要經過進一步的穩定性試驗及遺傳特性穩定性研究后，才能實現工業化生產。