高溫大曲曲房空氣中可培養細菌的分離鑒定及產酶特性

黃治國 劉 娜 衛春會 鄧 杰 鐘姝霞 陳 波 任志強

(1.四川輕化工大學釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.四川健能制藥有限公司，四川 自貢 643000；3.四川郎酒股份有限公司，四川 古藺 646523)

大曲培養發酵過程中，空氣中棲息著大量微生物，其種類、濃度以及群落結構直接影響大曲中微生物的群落結構及大曲質量，進而影響大曲酒的生產[1]。同時，因不同的地理氣候環境，不同產地的大曲中微生物群落結構也有所差異，通過對曲房空氣中微生物的研究可為大曲中微生物的群落結構提供一定的理論基礎[2-3]。

醬香型白酒獨特的醬香味是眾多微生物交織在一起共同作用的結果，很難確切地描述單個微生物在釀造過程中不同時間的具體作用。大曲生產的主要場所是制曲車間，曲的質量會直接影響酒的質量、風格和出酒率。目前，大曲的生產工藝大多沿用自然接種的傳統方式，其中微生物主要來源于環境空氣、制曲原料和制曲用水，而空氣微生物對曲的質量有重要影響[4]。生產實踐[5]表明在傳統工藝下，老曲房制曲效果較新曲房更佳，這是由于老曲房中的有益微生物種類及數量較新曲房更豐富。

高溫大曲在醬香型白酒生產中既作為糖化發酵劑，也是發酵原料。發酵過程中，曲房空氣微生物對釀制醬香型白酒具有重要作用，能將釀酒原料中的淀粉、蛋白質分解為糖和氨基酸，并產生一些高級醇、醛、酸、酚類、酯類等，進而形成天然的醬香風味[6-7]。文章擬以高溫大曲曲房空氣中的微生物為研究對象，對其進行篩選分離，同時采用分子生物學的方法對純種微生物進行鑒定，并對菌株的產酶特性進行分析，由此得到優勢功能微生物；測定生長曲線后進行高粱汁液態發酵，利用GC-MS分析技術分析其代謝產物，以期得到更完善的曲房優勢菌的功能性，為進一步指導釀酒用曲提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

采自川南某醬香型白酒廠曲房，用Coriolis μ型空氣生物采樣器在曲房空氣中進行多點取樣，4 ℃保藏，同一生產階段的曲房空氣取3個平行。

1.2 藥品與試劑

干酪素、NaCl、淀粉等：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、Tris-飽和酚、十二烷基硫酸鈉 (SDS)等：分析純，美國Sigma-Aldrich公司；

瓊脂糖：生化試劑，北京索萊寶科技有限公司；

dNTPs、TaqDNA polymerase、TaKaRa TaqTM、DL2000TM DNA Marker等：生化試劑，寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 儀器與設備

空氣生物采樣器：Corolis μ型，法國Bertin公司；

水平電泳儀：JY600+型，美國Bio-rad公司；

PCR儀：MyCycler型，美國Bio-rad公司；

顯微照相機：DM3000型，德國Leica公司；

全自動菌落分析儀：Scan1200型，上海智理科學儀器有限公司；

氣相色譜—質譜聯用儀：7890A-5975B型，美國Agilent公司。

1.4 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂粉15～20 g，NaCl 5 g，pH 7.4～7.6；

產淀粉酶培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂15～20 g，可溶性淀粉10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2；

產蛋白酶培養基：牛肉膏10 g，干酪素10 g(先取用并加入少量NaOH助溶)，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.6～7.8；

產纖維素酶培養基：羧甲基纖維素鈉10 g，硫酸銨4 g，NaCl 1.25 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL；

耐酸培養基：牛肉膏蛋白胨液體培養基，用5 mol/L的乙酸調節pH至4.0；

耐乙醇培養基：牛肉膏蛋白胨液體培養基，冷卻后加入7%的無水乙醇備用。

1.5 試驗方法

1.5.1 空氣中微生物的分離純化與形態觀察 采用平板稀釋涂布法和革蘭氏染色法[8]。

1.5.2 微生物的鑒定

(1) DNA的提取：采用改良的CTAB法[9-10]。

(2) PCR擴增：選用細菌通用引物27F-1492r對DNA進行擴增，采用25 μL體系(2.5 μL 10×buffer、2 μL dNTP、1 μL 27F引物、1 μL 1492r引物、0.5 μL Taq、1 μL 模板、17 μL ddH2O)，其PCR反應程序為Touch Down PCR，94 ℃維持3 min；30個反應循環；94 ℃維持15 s，56 ℃ 維持30 s，72 ℃維持90 s；72 ℃維持10 min；4 ℃保溫。取5 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，再取5 μL DL2000TM DNA Marker作對照，160 V下電泳30 min，通過凝膠成像儀觀察。將PCR擴增產物送至成都擎科測序，測序結果在NCBI上進行比對并記錄。

(3) 上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'。

(4) 下游引物1492r：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

1.5.3 微生物特性研究

(1) 耐受性能：將分離純化后的菌株接種至特定培養基上，培養48 h后于600 nm處測定培養液OD值，以判斷其耐酸與耐乙醇能力。

(2) 產酶特性：將分離純化后的菌株接種至特定培養基上，培養24～48 h，觀察并記錄透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)，根據D/d分別進行菌株蛋白酶活力[8,11]、淀粉酶活力[12]以及纖維素酶活力[13]測定。

1.5.4 優勢菌株發酵產物研究

(1) 生長曲線：根據產酶特性篩選出性能優良菌株，將其活化并按體積分數10%接種至液體培養基中，37 ℃，160 r/min搖床培養，每2 h取樣，以未接種的培養基作為空白，測定OD600 nm并繪制生長曲線。

(2) 高粱汁液態發酵液：高粱粉與水按m高粱∶V水=1∶5 (g/mL)配制，水浴加熱2 h，加入質量分數為2%的液化酶(2 000 U/g)，60 ℃水浴液化1 h，再加入質量分數為2%的糖化酶(50 000 U/g)保溫糖化1 h；糖化結束后取一滴與碘液反應，不顯藍色即為反應徹底，過濾、澄清，取上清液，滅菌備用。菌體培養4 h后(對數期)按體積分數10%接入至高粱汁發酵液中。

(3) 發酵產物研究：發酵48 h后，取2 mg/mL的乙酸丁酯10 μL作為內標，利用固相頂空萃取[14]、CG-MS對發酵液進行檢測[15-16]，分析其代謝產物。

(4) GC-MS：

① 色譜條件：DB-WAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管色譜柱；進樣口溫度230 ℃；分流比20∶1；程序升溫：40 ℃保持1 min，5 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min；載氣為99.999%氦氣，載氣流速1 mL/min。

② 質譜條件：電離電壓70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式為EI；質量掃描范圍m/z20～500；溶劑延遲3 min。

1.5.5 數據分析

(2) 測序結果在GenBank中運用BLAST進行比對，找出相似序列并下載，用DNAMAN軟件進行序列比對并進行人工修正。根據Kimura 模型運用MEGA6.0軟件進行系統發育樹的分析與構建。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離純化

通過對高溫大曲曲房空氣細菌進行分離與純化，根據其形態特征不同共篩出13株菌，并依次編號為S-1、S-2、…、S-13。通過形態觀察、分子生物學鑒定出8種菌，分別為S-1血紅鞘氨醇單孢菌(Sphingomonassanguinis)、S-3枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、S-5Massiliasp.、S-7解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、S-8Sphingobacteriumsp.、S-11蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、S-12Pedobactersuwonensis和S-13Delftiasp.，其菌落圖及菌落形態特征分別見圖1和表1，革蘭氏染色結果見圖2。

圖2 曲房空氣中細菌革蘭氏染色鏡檢圖Figure 2 The bacterial Gram staining microscopy chart from the air of Daqu fermentation room (100×)

表1 曲房空氣中細菌的菌落形態特征Table 1 Morphological characteristics of bacterial colony in the air of Daqu fermentation room

圖1 曲房空氣中細菌群落形態圖Figure 1 The pictures of bacterial colony isolated from the air of Daqu fermentation room

2.2 細菌鑒定

2.2.1 PCR擴增 通過手提法提取菌株基因組DNA，采用核酸蛋白微量檢測儀檢測DNAOD260nm/OD280 nm為1.70～1.90，表明DNA質量較好，可用于PCR擴增。由圖3可知，1 500 bp處出現清晰可見的熒光條帶，表明產物可用于分析和測序。

圖3 菌株PCR擴增產物電泳圖Figure 3 Electrophoresis of PCR amplification products of strains

2.2.2 菌株的系統發育樹 純化的PCR產物經測序后，將其16S rDNA序列在Gen-Bank核酸序列數據庫中進行同源性比較，結果表明其與Gen Bank數據庫中已知菌的16S rDNA序列具有100%相似性，結合形態學特征可以判斷為同種。將相似性較高的13株菌構建系統發育樹，結果如圖4所示，其中芽孢桿菌屬最多，與何明國等[17-19]的研究結果一致，這是由于空氣中缺乏水分和營養物質因而不利于微生物生長，芽孢桿菌屬的菌株可以產生芽孢，具有極強的抗逆性，對惡劣的環境有較強的適應性。此外，張明春等[20-21]對大曲微生物進行了分析，發現芽孢桿菌屬在大曲中為絕對優勢屬，其優勢細菌主要為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌等，其在釀酒環境中普遍存在，對白酒發酵及風味形成都具有重要影響。另一方面，在曲房空氣中分離出大量具有良好釀造性能的細菌，也表明經過長期的生產，曲房空氣中細菌群落與大曲生產密切相關[22]。

圖4 高溫大曲曲房空氣中細菌16S rDNA系統發育樹Figure 4 Phylogenetic tree of bacterial 16S rDNA sequence and other relative species from the air of Daqu fermentation room

高溫大曲曲房空氣中分離出的8種菌株，其中，S-13Delftiasp.能夠利用L-苯丙氨酸、乳糖、葡萄糖、蔗糖等[23]，其在增塑劑和除草劑等的生物降解方面也有重要作用[24]；S-11蠟樣芽孢桿菌能分解碳水化合物且不產氣，在葡萄糖肉湯中厭氧培養產酸[25]；S-7解淀粉芽孢桿菌會影響醬香型白酒風味物質的生產，可以通過發酵代謝產生四甲基吡嗪、2-戊基呋喃和庚醇等多種香味物質成分[26]。

2.3 細菌特性分析

2.3.1 耐受性能 前期試驗發現，高溫大曲曲房空氣中分離得到的細菌在pH>4.0時均能很好地生長，且其最大耐乙醇濃度為7%，故根據細菌的生長繁殖情況，選取pH 4.0、7%乙醇濃度條件下對比研究8種菌的耐酸性和耐乙醇能力，其結果見圖5。

由圖5可知，高溫大曲曲房空氣中分離的8種細菌在pH 4.0條件下，其耐受性能均較差，S-13的耐受能力最低，但S-11的耐酸能力顯著高于其他菌株(P<0.05)。7%乙醇濃度下，8株菌的耐受性能均較差，但S-7耐受能力顯著高于其他菌株(P<0.05)，且其他菌株均有一定的耐受能力。

2.3.2 產酶特性 分離純化后的細菌分別接種至產纖維素酶、產淀粉酶和產蛋白酶的培養基中，其產酶菌落圖見圖6。

圖6 產酶菌落圖Figure 6 Enzyme-producing colony diagram

由圖7可知，同時具有纖維素分解能力、淀粉和蛋白水解能力的菌株為S-3(枯草芽孢桿菌)、S-7(解淀粉芽孢桿菌)、S-11(蠟樣芽孢桿菌)；具有纖維素分解能力和淀粉水解能力的菌株為S-5(Massiliasp.)；僅具有淀粉水解能力的菌株為S-13(Delftiasp.)。這些菌株有待進一步研究以探討其在制曲及釀酒中應用的可能性，與王濤等[18]的研究結果相似。產纖維素的4株菌不僅形成菌落，而且還有明顯的透明圈，表明其產纖維素酶能力較強，可對其進行進一步研究；產淀粉酶的5株菌中有4株的透明圈與菌落面積的比值為1.0～2.0，且S-13菌的比值達5.1，說明這株菌高產淀粉酶，有進一步研究的價值；產蛋白酶的3株菌透明圈與菌落面積的比值為1.5～3.0，其中S-7菌的比值最大為2.77，表明S-7菌對蛋白質的水解能力顯著強于其他細菌(P<0.05)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 高溫大曲曲房空氣中細菌的耐受性Figure 5 The bacteria tolerance research in the air of high temperature Daqu fermentation room

顏林春[27]通過高溫大曲中微生物產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等特性，以透明圈法從分離到的芽孢桿菌中篩選出產特定酶類(纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶等)酶活性髙的芽孢桿菌。通過耐熱性、抑制性和拮抗性試驗表明，產特定酶類且酶活性高的芽孢桿菌菌株均能應用于強化高溫大曲制作。產酶試驗發現，從醬香型大曲曲房空氣微生物中分離得到的芽孢桿菌大多能分泌高活性的胞外產物酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶。此外，通過菌株部分釀造性能分析發現，有些菌株具備2種以上的釀造特性，如S-3菌株同時具備纖維素利用、淀粉水解和pH 4.0 耐受能力較好；S-11菌株同時具備蛋白質分解、纖維素分解、淀粉水解且7%乙醇耐受能力較好。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖7 高溫大曲曲房空氣細菌的產酶特性Figure 7 The bacteria enzyme production features research in the air of high temperature Daqu fermentation room

2.4 優勢菌株發酵產物分析

根據產酶特性篩選出3株優勢菌株，分別為S-3(枯草芽孢桿菌)、S-7(解淀粉芽孢桿菌)、S-11(蠟樣芽孢桿菌)，其生長曲線見圖8，發酵產物分析結果見表2。由圖8 可知，3株菌均能在牛肉膏蛋白胨培養基上良好生長，前期生長速率快，4 h后進入對數生長期，培養20 h時的OD值達最大，隨后進入平緩期。

圖8 S-3、S-7、S-11生長曲線Figure 8 S-3,S-7,S-11 Growth curve

由表2可知，3-羥基-2-丁酮是這些菌的優勢產物，且均會產生一些吡嗪類物質，如2-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪，還含有少量酚類、酯類等芳香類物質。菌株S-3共產生7種風味產物，其中3-羥基-2-丁酮、2-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪含量較高，其他醇類、酚類物質含量較少；菌株S-7共有10種代謝產物，其主要代謝產物除3-羥基-2-丁酮、2-甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪外，還含有大量的2,3-丁二醇，其他酚類物質含量較少；菌株S-11產生的風味物質種類較多(共13種)，3-羥基-2-丁酮含量>4.000 μg/mL，并產生大量己酸，其他酚類種類較多。3-羥基-2-丁酮又名乙偶姻，具有甜香、奶制品香，并帶有脂肪風味；3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇是產生香味物質四甲基吡嗪的前體物質[28]，四甲基吡嗪又名川穹嗪，是許多食品的風味物質，同時也是其他香味物質的前體，具有焙烤香，是中國白酒特有的功能性成分。黃永光等[29]從醬香型大曲中篩選出枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌及解淀粉酶芽孢桿菌，其代謝產物有乙偶姻、吡嗪等物質。

表2 優勢菌株發酵產物分析?Table 2 Analysis of fermentation products of dominant strains μg/mL

3 結論

(1) 以川北某醬香型酒廠高溫大曲曲房空氣微生物為原料，經分離、純化培養得13株菌，通過形態觀察、分子生物學鑒定出8種菌，分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、Pedobactersuwonensis、血紅鞘氨醇單孢菌(Sphingomonassanguinis)、Massiliasp.、Delftiasp.和Sphingobacteriumsp.。

(2) 對8株菌進行產酶特性試驗，發現芽孢桿菌的耐受性較強，并且芽孢桿菌大多能分泌高活性的胞外產物酶，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌均能產蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶，可以加速釀酒原料中的蛋白質、淀粉等轉變為糖、氨基酸等。

(3) 由產酶特性得到的3株優勢功能菌株分別為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。按體積分數10%接種至高粱汁發酵液中，運用GC-MS技術分析其代謝產物，結果發現3-羥基-2-丁酮是這些菌的優勢產物，且四甲基吡嗪含量較高。在利用現代分子技術解析醬香型大曲細菌的基礎上，后續可進一步對真核微生物區系及其相互協同制約的代謝機制進行分析和探討。