TaqMan-rRT-PCR檢測豬霍亂沙門菌方法的建立和實驗室評價

張景山，李 旭，閆梅英，闞 飆，樊粉霞

豬霍亂沙門氏菌是非傷寒沙門菌的一種，是引起仔豬副傷寒的主要病原菌[1-2]，也容易侵染人[3]，人感染后主要表現為高熱及菌血癥等全身性感染癥狀[2-4]，但臨床癥狀不典型，很難與傷寒及副傷寒沙門菌引起的腸熱癥及其他非沙門菌引起的人類發熱癥狀區分，如布魯氏菌病、鉤端螺旋體病、斑疹傷寒及侵襲性金黃色葡萄球菌感染等。在發達國家，沙門菌引起的腹瀉仍是公共衛生問題，但血液感染傷寒及非傷寒沙門菌的病例很少；在非洲，非傷寒沙門菌感染引起發熱病例很常見[5]；在我國，也有豬霍亂沙門菌引起敗血癥的報道[6-8]。

利用沙門菌增菌液進行細菌分離培養是傳統鑒定豬霍亂沙門菌的方法[9-11]。對分離得到的疑似菌落進行生化及血清型凝集鑒定，需要3～5 d，耗時費力，同時血清凝集反應及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等存在交叉反應、特異性不高及敏感性低等一些問題，這樣很容易引起病例漏診、誤診而延誤治療。ELISA法診斷豬霍亂沙門菌比傳統的方法時間短[12]，但豬霍亂沙門菌與丙型副傷寒沙門菌兩者的抗原式相同，均可引起血液感染，且利用血清凝集試驗以及ELISA診斷疑似樣本時會出現交叉[13]，最終準確鑒別還需要特殊生化反應[14]。沙門菌血清分型鑒別主要基于細菌細胞壁脂多糖(O抗原)和鞭毛抗原(H抗原)[15]，鞭毛抗原的編碼基因兩端在不同血清型沙門菌間高度保守，中間區域高度變異，有時能夠根據變異區基因序列找到特異引物用于區分不同的血清型[16]，但高度變異的特性作為分子檢測靶標時也存在結果不準確的隱患。尋找簡單、特異的單基因分子診斷方法對豬霍亂沙門菌的快速靈敏診斷以及鑒別排除十分必要，也是傳染病檢測、監測和應急中亟待解決的關鍵問題。

已有研究利用核酸擴增(PCR)檢測豬霍亂沙門菌的報道[17-18]，但一般是用樣本DNA為模板進行擴增。由于DNA可能是來源于處于感染狀態的活細菌，也有可能是來源于死亡細菌的DNA殘留，如果檢測標本是原始樣本，在不能培養出菌株的情況下，無法最終判斷陽性樣本中細菌處于活的狀態還是死亡細菌殘留的DNA，導致假陽性結果。另外，PCR檢測不同血清型沙門菌，也需要以特異基因片段作為靶標。本研究經過不同血清型沙門菌基因組序列分析，篩選到豬霍亂沙門菌的保守、特異基因SC0358，根據SC0358的基因序列，設計基于TaqMan方法的逆轉錄實時聚合酶鏈反應(reverse transcriptional real-time polymerase chain reaction, rRT-PCR)所用引物和探針，簡寫為TaqMan-rRT-PCR，進而驗證基因及方法的特異性，并優化反應體系，以純菌、血樣本模擬等分析了反應體系的敏感性，建立了快捷、特異和高靈敏的診斷豬霍亂沙門菌的TaqMan-rRT-PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1豬霍亂沙門菌特異基因尋找和引物探針設計 根據以往的研究[19]，我們對豬霍亂沙門菌的特有基因進行了篩選，數據的分析過程簡述為：利用R腳本，分析比對GenBank中所有豬霍亂沙門菌已知序列，初步獲得這些全基因組序列共有的基因序列，再將這些共有序列與其他血清型沙門菌及人類基因組(人類EST庫)進行比對分析，最終獲得豬霍亂沙門菌特異基因SC0358。分析過程中，判定基因是否存在的標準為：基因序列一致性若<50%，則認為該基因不存在；若≥50%，則認為該基因存在。根據豬霍亂沙門菌參考菌株SC-B67(NC_006905.1)中SC0358基因(Gene ID: 3332775)序列，利用Beacon Designer軟件設計相應的TaqMan-rRT-PCR引物(表1)。

表1 實驗所用引物

1.2實驗用菌株及培養 本研究所用菌株均來自中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，所有菌株均經過生化及血清型(群)鑒定。其中傷寒沙門菌(S.Typhi)10株、甲型副傷寒沙門菌(S.ParatyphiA)4株、乙型副傷寒沙門菌(S.ParatyphiB)2株、丙型副傷寒沙門菌(S.ParatyphiC)20株、豬霍亂沙門菌(S.Cholerasuis)26株、阿貢納沙門菌(S.Agona)3株、腸炎沙門菌(S.Enteritidis)8株、鼠傷寒沙門菌(S.Typhimurium)8株、湯卜遜沙門菌(S.Thompson)4株、德爾卑沙門菌(S.Derby)4株、山夫登堡沙門菌(S.Senftenberg)2株、韋太夫雷登沙門菌(S.Weltevreden)2株、阿伯丁沙門菌(S.Aberdeen)1株、鴨沙門菌(S.Anatum)1株、火雞沙門菌(S.Meleagridis)1株、圣地亞哥沙門菌(S.Sandiego)1株、烏干達沙門菌(S.Uganda)1株、肯塔基沙門菌(S.Kentukey)1株、夢得維的亞沙門菌(S.Montevideo)1株、斯坦利沙門菌(S.Stanly)1株、波摩那沙門菌(S.Pomona)1株、波茨坦沙門菌(S.Potsdam)1株、姆班達卡沙門菌(S.Mbandaka)1株、伊斯坦布爾沙門菌(S.Istanbul)1株、非丁伏斯沙門菌(S.Hvittingfoss)1株、利奇菲爾德沙門菌(S.Litchfield)1株、印第安納沙門菌(S.Indiana)1株、蓋茨黑德沙門菌(S.Gateshead)1株、維爾肖沙門菌(S.Virchow)1株、威廉斯堡沙門菌(S.Wilhelmsburg)1株、旺茲沃斯沙門菌(S.Wandsworth)1株、胥伐成格隆沙門菌(S.Schwarzengrund)1株、利文斯通沙門菌(S.Livingstone)1株、利物浦沙門菌(S.Liverpool)1株、斯坦利維爾沙門菌(S.Stanleyville)1株。另外，本研究也選用其他腸道常見病原菌O1、O139血清群霍亂弧菌(V.choleraeserogroup O1，V.choleraeserogroup O139)各2株、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)3株、志賀菌(Shigellaspp.)4株、致瀉性大腸桿菌(DiarrhealE.coli)4株以及引起發熱并可在血液標本中分離到的金黃色葡萄球菌(S.aureus)5株、肺炎鏈球菌(S.peumoniae)1株、伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)1株、鉤端螺旋體(Leptospira)1株、嗜肺軍團菌(Legionella)1株、腦膜炎奈瑟菌(N.meningitis)1株、立克次體(Rickettsia)1株、布魯氏菌(Brucella)3株等共29株作為傷寒沙門菌的特異性評價檢測菌株。菌株培養所用培養基：肺炎鏈球菌(哥倫比亞血平板)、嗜肺軍團菌(GVPC液體培養基)、伯氏疏螺旋體(BSK培養基)、鉤端螺旋體(Korthof培養基)、腦膜炎奈瑟菌(血瓊脂培養基)、立克次體(Vero-E6細胞培養)和布魯氏菌(布氏瓊脂)，其余菌株均用Luria-Bertani培養基。

1.3反應體系與擴增條件 以提取的病原菌的RNA為模板，參照One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒說明書(Takara, code No.RR064A)，采用20 μL反應體系：10 μL 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ(1×)、0.4 μL TaKaRa Ex Taq HS(5 U/μL)、0.4 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ、0.5 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L)、0.5 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L)、1 μL 探針引物、RNA模板2 μL、5.2 μL 無RNase 水。使用CFX96熒光PCR儀對RNA樣本進行反轉錄及核酸擴增，反應條件為：42 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s; 95 ℃ 5 s, 58 ℃ 20 s，40個循環。對于Ct值≤35的擴增結果判定為陽性。以相應的Ct值為縱坐標，橫坐標為細菌濃度的對數值，繪制TaqMan-rRT-PCR標準曲線方程。

普通PCR反應體系：5 μL 10×擴增緩沖液(含Mg2+)、4 μL dNTP混合物(每種濃度為2.5 mmol/L)、上游和下游引物分別 1.5 μL(10 μmol/L)、1 μL Pfu(5 U/μL)、2 μL模板DNA(50 ng/反應)、35 μL ddH2O。反應條件為：95 ℃ 5 min，35個循環：95 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min。

1.4血模擬標本的制備及RNA提取 從平板上挑取新鮮培養的單克隆，液體振搖培養5 h，菌液濃度經平板計數(6.5×108cfu/mL)，將培養液按10倍梯度系列稀釋為101～106cfu/mL，分別用2 mL新鮮的人抗凝血與同體積的各濃度菌液混勻，室溫放置30 min，作為全血模擬標本。對上述模擬標本進行豬霍亂沙門菌RNA的提取(QIAamp UCP PurePathogen Blood field test Kit，QIAGEN公司)，將不加菌液的血液作為陰性對照組(NC)。

1.5純培養細菌的RNA提取 將從平板上挑取的單克隆豬霍亂沙門菌過夜培養，第2天，按1∶100接種到新鮮的培養液里，菌液濃度為OD=0.6左右時，收集菌液，提取總RNA(RNeasy Minikit，QIAGEN公司)。對提取的總RNA進行濃度測定后，進行10倍梯度稀釋，最后選取6個濃度梯度：0.005、0.05、0.5、5、50和500 pg/μL，每個濃度的樣本各取2 μL作為模板，分析TaqMan-rRT-PCR反應體系的敏感性。

1.6細菌的DNA提取 挑取平板上的新鮮單克隆，接種到LB液體培養基中，菌液濃度為OD=0.6左右時，收集菌液，提取總DNA，按照相應試劑盒(QIAGEN)說明書操作步驟進行。

2 結 果

2.1TaqMan-rRT-PCR檢測體系建立 根據篩選到的豬霍亂沙門菌的特異基因SC0358，設計普通PCR引物(表1)，選取從我國不同地點及時期分離到的豬霍亂沙門菌，共計26株，提取DNA為模板，對SC0358進行全基因擴增，結果得到大小為501 bp的目的條帶，隨機選擇5個PCR產物進行測序、比對分析，DNA序列一致率為100%，說明SC0358在豬霍亂沙門菌中高度保守。同時利用34種血清型116株沙門菌及29株非沙門菌進行擴增，結果均為陰性，說明SC0358是豬霍亂沙門菌的特異、保守的基因，可作為診斷豬霍亂沙門菌感染的分子靶標。利用軟件Beacon Designer 設計針對該基因的TaqMan-rRT-PCR引物(表1)，以豬霍亂沙門菌的純菌樣本提取的總RNA為模板進行擴增反應，最終確定的反應條件、引物用量及退火溫度詳見1.3(反應體系與擴增條件)。

2.2TaqMan-rRT-PCR特異性分析 以48種145株細菌為檢測樣本，進一步分析TaqMan-rRT-PCR引物的特異性，其中26株豬霍亂沙門菌檢測結果均為陽性，沙門菌屬的其余34種血清型90株菌擴增結果均為陰性，其他常見的腹瀉癥狀致病菌及臨床常見的發熱病原菌擴增均為陰性。同時將這些樣品進行了普通PCR檢測，TaqMan-rRT-PCR與普通PCR檢測結果一致。結果說明：根據SC0358基因序列，設計TaqMan-rRT-PCR體系檢測引物，可很好的識別豬霍亂沙門菌，具有非常高的血清和菌種特異性，目前檢測的菌株基礎上分辨率可達100%。

2.3以純菌樣本RNA為模板的TaqMan-rRT-PCR敏感性分析 提取豬霍亂沙門菌純培養物的RNA，按10倍梯度稀釋后作為模板，檢測TaqMan-rRT-PCR反應的敏感性，本實驗重復3次，結果一致(圖1A)。本研究結果顯示檢測SC0358基因的敏感性為5 fg/反應，大約為10個拷貝/反應。以反應Ct值為縱軸，以模板RNA的拷貝數的對數值為橫軸，得到的標準曲線方程為：y=-1.53ln(x)+36.196，R2=0.999 6(圖1B)，說明引物的擴增效率很高。

A：純菌RNA樣本TaqMan-rRT-PCR敏感性分析，提取的豬霍亂沙門菌總RNA經系列梯度稀釋后，作為反應的模板。

2.4血液模擬標本中TaqMan-rRT-PCR敏感性分析 將豬霍亂沙門菌培養液按10倍梯度稀釋至不同濃度后，與新鮮的血液混勻，室溫放置后，從模擬血標本中提取豬霍亂沙門菌的RNA，用50 μL的無RNase的無菌水溶解每個樣品的RNA產物，取其中2 μL作模板，進行TaqMan-rRT-PCR敏感性分析，進行了3次獨立重復實驗，結果一致。如圖2A所示：以豬霍亂沙門菌特異基因SC0358為靶標的TaqMan-rRT-PCR反應體系檢測血模擬標本的最低檢測下限為25 cfu/mL。以反應Ct值為縱軸，模板RNA拷貝數的對數值為橫軸，得到的標準曲線方程為：y=-1.546ln(x)+37.451，R2=0.989 3(圖2B)，說明引物的擴增效率很高。

A：血模擬樣本RNA的TaqMan-rRT-PCR敏感性分析，提取豬霍亂沙門菌血模擬樣本的總RNA經系列梯度稀釋后，作為反應的模板。a: 2.5×106 cfu/mL；b: 2.5×105 cfu/mL；c: 2.5×104 cfu/mL；d: 2.5×103 cfu/mL；e: 2.5×102 cfu/mL；f: 2.5×101 cfu/mL；NC: 陰性對照。B: 模板濃度和Ct值之間的相關系數分析。

3 討 論

靶標的特異性是分子診斷最關鍵一步。基于全基因組、多基因和單基因的病原菌檢測技術都是基于病原菌的遺傳物質DNA或RNA的特征識別。尋找病原微生物的特異基因并據此設計引物，通過熒光定量PCR檢測病原菌仍舊是方便快捷、性價比高的檢測手段。另外，當前基因組測序和生物信息學分析技術快速發展，大量病原微生物進行了基因組測序，病原基因組數據庫包括的種類和數量也急劇增加，使得通過基因組數據庫的比對、篩選到某種病原微生物的特異基因序列變得很容易。我們可以不經過大量菌株實驗測試，只需將基因組數據庫中存儲的各類病原微生物基因組序列進行比對，就可以尋找、判斷一種病原體的特異基因或片段序列。

目前，已建立通過檢測編碼特異抗原的基因鑒別病原菌的檢測方法[13, 20-23]，也有根據病原菌特有保守的非抗原基因的檢測方法[24-25]。分子檢測所選的靶基因應為待檢病原微生物的特有識別序列，這是建立特異分子檢測方法的基本要求。根據沙門菌毒力島(SPI-1)三型分泌系統中編碼伴侶分子的invB基因序列，設計檢測豬霍亂沙門菌的PCR引物，雖然豬霍亂沙門菌可擴增出陽性目的條帶，但擴增產物的特異性比較低，此序列與NC006905、AE008832、STU08279和AE017220序列同源性高達99%～100%[17]，所以利用invB基因并不能直接區分豬霍亂沙門菌與其他血清型沙門菌，還需其他的血清學及生化實驗輔助。

目前為止，經數據庫序列比對，經本研究所用沙門菌屬及臨床癥狀類似的非沙門菌致病菌的核酸擴增篩選，確定SC0358基因是豬霍亂沙門菌的特異基因，SC0358編碼DNA穩定蛋白。根據SC0358全基因序列，設計TaqMan-rRT-PCR的引物，能很好地區分豬霍亂沙門菌與其他常見的沙門菌血清型，此方法可應用于發熱病原的鑒別診斷。

以TaqMan技術為基礎建立的rRT-PCR方法檢測豬霍亂沙門菌有明顯的優勢。首先，除內外引物外，還有探針序列，3條序列覆蓋的3個區域可增加檢測的特異性。其次，在臨床和疫情現場，判斷病例樣本中是否存在活菌或處于應急感染期至關重要。TaqMan-rRT-PCR反應體系所用的模板為RNA，陽性結果表明處于感染期，致病菌處于活的狀態，可排除死菌殘留DNA的假陽性結果。另外，細菌染色體DNA為單拷貝，而基因轉錄產物mRNA具有明顯多的拷貝數，因此，對于細菌相關基因轉錄的mRNA進行檢測，具有提高方法敏感性和明確活菌感染的優勢。最后，我們以豬霍亂沙門菌特有基因SC0358建立的TaqMan-rRT-PCR反應體系分析純菌、血模擬樣本的敏感性分別為5 fg/反應(大約為10個拷貝/反應)、25 cfu/mL，優于之前的檢測體系[18-19]。

鑒于豬霍亂沙門菌是一類重要的人獸共患菌，也是食品安全中需要防范的病原菌；另外，豬霍亂沙門菌也可致血流感染，因此以發熱和血液為標本進行病原微生物檢測時，應作為一種篩查的病原體；又因為豬霍亂沙門菌在沙門菌血清型鑒定上難與丙型副傷寒沙門菌進行血清凝集鑒別，本研究建立的TaqMan-rRT-PCR檢測豬霍亂沙門菌的反應體系，為解決上述問題提供很好的方法。本研究特異性和敏感性數據均來自豬霍亂沙門菌純培養及血液模擬標本，將來需要進一步收集來自食品、臨床病人或者動物的實際標本，對本研究建立的豬霍亂沙門菌TaqMan-rRT-PCR檢測體系進一步驗證和完善。

利益沖突：無