RPA-LFD技術(shù)快速檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的應(yīng)用

魯 瑤，趙麗麗，李馬超，劉海燦，趙秀芹，劉志廣，萬康林，樓永良

利福平耐藥結(jié)核病(Rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)是指患者感染的MTB對利福平耐藥的結(jié)核病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計(jì)，2019年全球RR-TB新發(fā)病例大約46.5萬例，其中78%為耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)，死亡人數(shù)約18.2萬例，我國為MDR-TB高負(fù)擔(dān)國家之一，占14%，居世界第二，而其治療成功率僅為57%[1]。MDR-TB是指結(jié)核病患者感染的MTB至少同時(shí)對異煙肼和利福平耐藥的結(jié)核病。研究表明RR-TB通常同時(shí)對異煙肼耐藥[2-3]，并且結(jié)核分枝桿菌對利福平是否耐藥也決定了臨床上不同的治療方案[4],所以對結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的快速檢測意義重大。rpoB是利福平作用的靶基因，其作用機(jī)制是通過與RNA聚合酶β亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致細(xì)菌死亡。在我國的結(jié)核病患者中，90%～95%的耐利福平結(jié)核分枝桿菌在rpoB中的利福平耐藥決定區(qū)(即rpoB基因507-533位氨基酸密碼子)存在突變[5]。已有不少研究表明，利福平耐藥決定區(qū)中最常見的突變位點(diǎn)位于531、526、516位氨基酸密碼子[6]。

用于檢測基因突變的常規(guī)診斷技術(shù)大多以實(shí)時(shí)熒光定量PCR或DNA測序技術(shù)作為基礎(chǔ)，這些方法不僅費(fèi)時(shí)而且所需儀器設(shè)備要求高[7]。重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)技術(shù)是一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。它用大腸桿菌重組酶和單鏈結(jié)合蛋白替代了PCR中加熱變性這一過程，用一種單鏈置換聚合酶替換了TaqDNA聚合酶，使擴(kuò)增反應(yīng)在37 ℃左右的恒溫條件下就能進(jìn)行[8]。本研究將該技術(shù)與側(cè)流層析試紙條技術(shù)相結(jié)合，即在基于RPA反應(yīng)設(shè)計(jì)的下游引物5′端標(biāo)記羧基熒光素(FAM)，上游引物即探針的5′端標(biāo)記生物素(Biotin)或地高辛(Dig)。若檢測位點(diǎn)發(fā)生基因突變則RPA反應(yīng)不能進(jìn)行，若檢測位點(diǎn)未發(fā)生突變，RPA反應(yīng)順利進(jìn)行以形成雙標(biāo)記的RPA擴(kuò)增產(chǎn)物，該產(chǎn)物可與層析液中的膠體金標(biāo)記的FAM抗體結(jié)合，并被試紙條上的抗生物素抗體或抗地高辛抗體捕獲以形成三明治樣結(jié)構(gòu)從而在試紙條上顯現(xiàn)出肉眼可見條帶。

本研究采用RPA-LFD技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌中rpoB的531、526、516位氨基酸密碼子進(jìn)行突變檢測，并把RRDR測序結(jié)果和RPA-LFD檢測結(jié)果分別與比例法藥敏試驗(yàn)進(jìn)行比較，以評價(jià)該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1菌株來源 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室保存的臨床送檢菌株(湖南62株，安徽120株)及結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv，ATCC27294)。采用羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)后用于本研究。

1.2結(jié)核分枝桿菌比例法藥物敏感性檢測 對182株臨床分離株進(jìn)行藥物敏感性檢測。實(shí)驗(yàn)操作遵循《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行,利福平在含藥培養(yǎng)基中的濃度為40.0 μg/mL[9]。

1.3DNA的提取 將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株接種到羅氏培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2～3周，有可見菌落生長后刮取一接種環(huán)菌落置于裝有1 mL無菌水的螺口管中，80 ℃水浴加熱30 min滅活后，12 000 r/min離心5 min，盡量吸凈上清后加入1 mL無菌水，吹打混勻，12 000 r/min離心5 min，盡量吸凈上清后加入150 μL無菌水，100 ℃加熱20 min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清待用。

1.4rpoB利福平耐藥決定區(qū)基因擴(kuò)增及突變分析 上游引物：5′-CTTGCACGAGGGTCAGACCA-3′；下游引物：5′-ATCTCGTCGCTAACCACGCC-3′。擴(kuò)增體系(30 μL)：2×Taq master mix(TaKaRa)15 μL，引物(5 μmol/L)各1 μL，DNA樣品1 μL及水12 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s；72 ℃ 5 min[10]。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序分析，引物合成和測序工作均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。DNA測序結(jié)果與GenBank上公布的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株對應(yīng)基因序列進(jìn)行比對分析，獲得每株菌在利福平耐藥決定區(qū)的突變特征。

1.5RPA-LFD的引物探針篩選 根據(jù)GenBank公布的結(jié)核分枝桿菌rpoB基因的DNA序列，設(shè)計(jì)檢測rpoB中531、526、516位密碼子的3條上游引物即探針(rpoB-531、rpoB-526、rpoB-516)和1條下游引物rpoB-A。RPA的引物設(shè)計(jì)不同于普通PCR，有其特殊的設(shè)計(jì)原則。另外，對設(shè)計(jì)的引物和探針還應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。表1中的引物和探針均為優(yōu)化后的產(chǎn)物。

1.6RPA-LFD反應(yīng)分析利福平耐藥性 RPA反應(yīng)試劑盒：安普未來DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒基礎(chǔ)型(MIRA)。LFD試劑盒：Milenia GenLine HybriDetect(GieBen, Germany)。在普通PCR反應(yīng)管中配制RPA反應(yīng)體系(表2)。經(jīng)短暫離心后加入MIRA反應(yīng)管，同時(shí)在管蓋中加入2.5 μL Buffer B，蓋上管蓋后用手指彈打MIRA反應(yīng)管直到管內(nèi)液體與凍干粉充分混勻。最后通過離心甩下管蓋中Buffer B啟動反應(yīng)，39 ℃金屬浴反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后在1.5 mL EP管中加入48 μL RPA-Laufbuffer，再加入2 μL RPA反應(yīng)產(chǎn)物稀釋25倍。吹打混勻后吸取10 μL稀釋液加到試紙條上。另取一個(gè)EP管加入90 μL RPA-Laufbuffer，將試紙條插入該EP管，待反應(yīng)4 min左右讀取結(jié)果。

表2 RPA反應(yīng)體系

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算RPA-LFD和DNA測序技術(shù)的檢測效率，用Kappa檢測來分析兩種結(jié)果的一致性。Kappa<0.4時(shí)為低度一致性；0.75≥Kappa≥0.4時(shí)為中度一致性；1.0≥Kappa>0.75時(shí)為高度一致性。

2 結(jié) 果

2.1比例法藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，182株臨床分離菌中有125株敏感菌，57株耐藥菌。

2.2rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)測序結(jié)果 182株臨床菌株中，130株菌在RRDR中未發(fā)生突變，其中125株為比例法藥敏試驗(yàn)敏感株，5株為比例法藥敏試驗(yàn)?zāi)退幹辍?2株菌在RRDR中存在突變，且比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果都為耐藥株。檢測到的突變株的突變類型及對應(yīng)突變株數(shù)量見表3。

表3 RRDR突變位點(diǎn)分析結(jié)果

2.3RPA-LFD檢測結(jié)核分枝桿菌RRDR突變結(jié)果 采用RPA-LFD方法共檢測182株臨床分離株，其中33株菌檢出531位密碼子突變，包括31株TCG531TTG突變菌株、2株TCG531TTT突變菌株。11株菌檢出526位密碼子突變，包括2株CAC526CGC突變菌株、1株CAC526AAC突變菌株、1株CAC526CCC突變菌株、1株CAC526TGC突變菌株、1株CAC526CTC突變菌株、2株CAC526GAC突變菌株、3株CAC526TAC突變菌株。4株菌檢出516位密碼子突變，包括3株GAC516GTC突變菌株、1株GAC516GGC突變菌株。圖1為代表各種突變類型菌株的檢測結(jié)果。

A: 1.H37Rv; 2.531 codon, TCG-TTG; 3.531 codon, TCG-TTT; 4.blank control；B: 1.H37Rv; 2.516 codon, GAC-GTC; 3.516 codon, GAC-GGC; 4.526 codon, CAC-CGC；5.526 codon, CAC-AAC; 6.526 codon, CAC-CCC; 7.526 codon, CAC-TGC; 8.526 codon, CAC-CTC; 9.526 codon, CAC-GAC; 10.526 codon, CAC-TAC; 11.blank control

2.4RPA-LFD和DNA測序技術(shù)的檢測效率 以傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。RPA-LFD檢測結(jié)果顯示：檢出48株突變株，均為耐藥株。檢出134株未發(fā)生突變，其中125株為敏感株，9株為耐藥株。以比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，RPA-LFD的靈敏度為84.2%，特異度為100.0%，陽性預(yù)測值為100.0%，陰性預(yù)測值為93.3%，Kappa值為0.880，說明兩種檢測方法的檢測結(jié)果具有高度一致性。同樣以比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，在利福平耐藥菌株中，發(fā)生RRDR突變的菌株占91.2%，未發(fā)生RRDR突變的菌株占8.8%。即用DNA測序法檢測利福平耐藥性的靈敏度為91.2%，特異度為100%,陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為96.2%，Kappa值為0.935(表4)，故而可認(rèn)為兩種檢測方法的檢測結(jié)果具有高度一致性。

表4 RPA-LFD和DNA測序檢測利福平耐藥的效率

2.5分析RPA-LFD的檢測時(shí)間 對于培養(yǎng)物核酸檢測，RPA反應(yīng)只需10 min，LFD檢測也僅需4 min左右即可判讀檢測結(jié)果，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程不足20 min即可完成，滿足了結(jié)核分枝桿菌RRDR常見突變位點(diǎn)快速檢測之需求。

3 討 論

全球約30%的人口受到結(jié)核病危害。耐多藥結(jié)核病已成為控制結(jié)核病傳播的主要障礙，如何快速診斷耐多藥結(jié)核病對全球結(jié)核病防治工作至關(guān)重要[11]。雖然在分子診斷領(lǐng)域，我們已經(jīng)在結(jié)核病的診斷和耐藥性檢測上取得了公認(rèn)的進(jìn)步，如XpertMTB/RIF系列技術(shù)、線性探針技術(shù)、全基因組測序技術(shù)、基因芯片技術(shù)以及可供實(shí)驗(yàn)室使用的基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的一系列商品化試劑盒[12]，但這些技術(shù)對設(shè)備和操作人員的技術(shù)要求高且耗時(shí)長。WHO建議發(fā)展中國家必須采用更加快速的分子診斷技術(shù)去檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌[1]。RPA作為一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它不僅具有其他核酸擴(kuò)增技術(shù)共有的高靈敏度、高特異度的特點(diǎn)；同時(shí)還具備低溫?cái)U(kuò)增、操作簡單、耗時(shí)短、對設(shè)備依賴性較低的優(yōu)點(diǎn)，可用于偏遠(yuǎn)地區(qū)傳染性疾病的快速診斷和床旁檢測技術(shù)的開發(fā)。RPA-LFD為結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷和耐藥檢測開拓了新的途徑,更滿足了當(dāng)前臨床快速檢測之需求。

由于單耐利福平結(jié)核分枝桿菌較少，對利福平耐藥的結(jié)核分枝桿菌通常伴隨其他藥物耐藥，最常見的就是異煙肼，據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計(jì)該比例高達(dá)78%[1]。這使得利福平耐藥相關(guān)位點(diǎn)成為了診斷MDR-TB的主要參考標(biāo)志物[13]。本研究以rpoB中531、526、516位氨基酸密碼子為靶標(biāo)設(shè)計(jì)了3條探針和1條通用下游引物，運(yùn)用RPA-LFD技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌在這3個(gè)位點(diǎn)上是否存在突變。研究結(jié)果顯示以比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，RPA-LFD檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的特異度高達(dá)100.0%，靈敏度為84.2%。DNA測序技術(shù)不僅顯示出100.0%的特異度，靈敏度也達(dá)到了91.2%。RPA-LFD的靈敏度低于DNA測序技術(shù)，主要是因?yàn)樾陆⒌腞PA-LFD技術(shù)只能檢測RRDR中531、516、526位密碼子的突變，而利福平耐藥的臨床菌株中還存在其他位點(diǎn)如522、533位密碼子的突變。另外，本研究建立的RPA-LFD技術(shù)可檢測出2種531位密碼子突變類型、2種516位密碼子突變類型、7種526位密碼子突變類型，提示其可以檢測的突變類型種類多，涵蓋了本實(shí)驗(yàn)182株臨床株中通過DNA測序可檢測到的所有突變類型。參考對利福平耐藥菌株rpoB基因突變類型的研究[14-15]，表明本研究已檢測的突變類型占該3個(gè)位點(diǎn)所有突變類型的95%以上。本研究建立并評估了一種簡便快速的用于檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥的方法，通過對RRDR中531、526、516位氨基酸密碼子的突變檢測來判斷結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥特征。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：①39 ℃恒溫反應(yīng)，只需一臺金屬浴就可完成反應(yīng)；②檢測時(shí)間短，RPA反應(yīng)只需10 min,LFD在4 min左右就可觀察結(jié)果；③操作簡單，檢測結(jié)果可直接肉眼觀察且無需特殊的檢測設(shè)備。當(dāng)然該方法也有不足之處：①當(dāng)進(jìn)行試紙條檢測時(shí)需要打開反應(yīng)管，容易產(chǎn)生氣溶膠對下一次反應(yīng)產(chǎn)生污染，因此應(yīng)在通風(fēng)良好處進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或分區(qū)操作；②本技術(shù)僅能檢測利福平耐藥常見的531、526和516位點(diǎn)的突變，因此不能替代常規(guī)的藥敏實(shí)驗(yàn)，尤其對于陰性結(jié)果須進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究作為一個(gè)初步研究，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本檢測數(shù)，針對更多的耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針，并且嘗試直接從痰標(biāo)本中提取DNA進(jìn)行RPA-LFD檢測，以求進(jìn)一步提高RPA-LFD對結(jié)核分枝桿菌耐藥性的臨床檢測性能和檢測速度。

利益沖突：無