Pin1和mTOR在鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤中的表達(dá)及臨床意義

孫文秀

（凌源市中心醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧 朝陽122500）

鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤（NIP）是耳鼻喉科常見的臨床上常見的一種良性腫瘤，中年男性為高發(fā)群體，發(fā)病率僅次于鼻部血管瘤，在鼻腔腫瘤中約占5%[1]。NIP病理特點(diǎn)表現(xiàn)為表層上皮呈分支狀或乳頭狀過度增生，其細(xì)胞增殖的活性水平較高[2]。NIP具有惡性腫瘤的侵襲性及破壞性行為，極易復(fù)發(fā)或惡變?yōu)榘┌Y，因此，又被歸屬于交界性腫瘤，即癌前病變，且多惡變?yōu)轺[狀細(xì)胞癌[3]。隨著鼻內(nèi)鏡手術(shù)技術(shù)的不斷提高，NIP的治愈率也明顯提高，但其復(fù)發(fā)及惡變率仍較高[4]。肽基脯氨酰異構(gòu)酶1（Pin1）是一種具有特異性功能的高度保守蛋白，主要調(diào)節(jié)有絲分裂相關(guān)蛋白酶[5]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種高度封閉的蛋白激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝[6]。Pin1和mTOR在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中的具有重要作用，但關(guān)于Pin1和mTOR在NIP表達(dá)的研究目前尚無相關(guān)報(bào)道，本研究旨在檢測Pin1和mTOR在NIP組織中的表達(dá)情況，以探討Pin1與mTOR表達(dá)的關(guān)系及其在NIP惡變中的作用，以期為NIP診斷治療和預(yù)后提供新的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年4至2018年6月本院收治的NIP患者（NIP組，n=81）和同期正常下鼻甲黏膜患者（正常下鼻甲黏膜組，n=60）作為研究對象。NIP組男59例，女22例；年齡40～75歲，平均年齡（57.36±7.49）歲。正常下鼻甲黏膜組男42例，女18例；年齡40～78歲，平均年齡（57.85±7.58）歲。兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。所有患者均對本研究知情同意，并自愿簽署知情同意書。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NIP診斷標(biāo)準(zhǔn)并確診[7]；②患者年齡＞18歲；③簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往存在慢性鼻鼻竇炎病史者；②既往存在變態(tài)反應(yīng)病史者。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 主要儀器：切片機(jī)（德國LEICA公司）、光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、低溫冰箱（韓電公司）、恒溫箱（武漢醫(yī)療儀器廠）；主要試劑：鼠抗人Pin1克隆抗體（青島捷世康生物科技有限公司）、鼠抗人mTOR單克隆抗體[微蒙（上海）生物科技有限公司）、濃縮型兔抗人CyclinD1單克隆抗體、DBA試劑盒及S-P超敏免疫組化試劑盒均由上海萬疆生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.2 檢測Pin1和mTOR蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)方法檢測病理組織標(biāo)本中Pin1和mTOR蛋白表達(dá)，采用切片機(jī)將石蠟包埋組織切成4 μm厚度，并置入60℃恒溫箱烤片30 min，取出自然冷卻晾置30 min，二甲苯脫蠟（40 min）后，依次放入100%、95%、80%及75%的乙醇中各10 min，PBS洗滌3次（每次5 min），蒸餾水浸泡5 min后加入3%過氧化氫溶液50 μL，在恒溫箱（20℃）孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活，PBS沖洗3次（每次5 min），加入50 μL的一抗（1:100）過夜（4℃），加入二抗孵育10 min（20℃），采用DBA試劑盒中的試劑進(jìn)行顯色，放入顯微鏡下觀察，顯色后用蒸餾水洗掉，終止顯色，蘇木素復(fù)染2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Pin1蛋白及mTOR蛋白顯色后，呈黃色或棕黃色則為陽性。隨機(jī)抽取每張切片的10個(gè)視野（×400），按陽性細(xì)胞所占的百分率和著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。陽性細(xì)胞百分比評分（PP）標(biāo)準(zhǔn)：①0分，陽細(xì)胞＜25%；②1分，25%≤陽性細(xì)胞百分比≤50%；③2分，50%＜陽性細(xì)胞百分比≤75%；④3分，陽性細(xì)胞百分比＞75%。染色強(qiáng)度評分（SI）標(biāo)準(zhǔn)：①0分，無染色；②1分，淡黃色；②2分，棕黃色；③3分，棕褐色。按照公式：免疫反應(yīng)評分（IRS）=PP×SI，并將IRS＞1分判斷為陽性表達(dá)[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Pin1和mTOR蛋白表達(dá)情況比較NIP組Pin1和mTOR蛋白陽性表達(dá)率分別為72.84%、79.01%，均明顯高于正常下鼻甲黏膜組表達(dá)率（1.67%、6.67%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Pin1蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，呈黃色至棕色，mTOR蛋白主要在胞漿中表達(dá)，呈黃色至棕褐色，見表1、圖1。

表1 兩組Pin1和mTOR蛋白表達(dá)情況比較[n（%）]Table 1 Comparison of Pin1 and mTOR protein expression between the two groups[n(%)]

圖1 Pin1和mTOR蛋白表達(dá)情況Figure 1 Protein expression of Pin1 and mTOR

2.2 Pin1和mTOR蛋白在NIP中表達(dá)的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，在NIP中Pin1和mTOR蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性（r=0.624，P=0.000）。

3 討論

NIP是常見的鼻腔鼻竇的良性腫瘤，在所有鼻部乳頭狀瘤中約占75%[9]。目前NIP的發(fā)病機(jī)制尚未明確，通常認(rèn)為人類乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是NIP發(fā)病的主要原因之一，尤其是高危型HPV與其復(fù)發(fā)及惡化密切相關(guān)，此外變態(tài)反應(yīng)、慢性炎癥、環(huán)境因素等也是高危影響因素[10]。NIP具有特殊的臨床特點(diǎn)及病理學(xué)特征，即對周圍組織結(jié)構(gòu)具有局部侵襲性，多中心生長及轉(zhuǎn)移，且發(fā)展迅速，少數(shù)伴有惡變傾向，因此，局部交界性腫瘤的特點(diǎn)[11]。目前對于NIP惡變的機(jī)制尚未明確，需進(jìn)一步深入研究。隨著腫瘤分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，腫瘤相關(guān)的因子指標(biāo)對NIP的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著重要的指導(dǎo)意義。

Pin1于20世紀(jì)90年代首次被發(fā)現(xiàn)，屬于多膚基脯氨酸順反同分異構(gòu)酶家族，直接影響蛋白功能活性，對細(xì)胞的有絲分裂具有重要調(diào)節(jié)作用[12]。相關(guān)研究顯示[13]，Pin1在多種惡性腫瘤中，尤其在鱗癌中存在過表達(dá)，并對腫瘤的發(fā)生及發(fā)展起重要作用。Pin1會激活JNK活化c-jun及協(xié)同Ras信號傳導(dǎo)通路，從而促進(jìn)CyclinD1的轉(zhuǎn)錄，且阻止Cyc11nD1從胞核移至胞漿降解，進(jìn)而使細(xì)胞周期紊亂，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，且敲除Pin1后，會導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，NIP組Pin1蛋白陽性率高于正常下鼻甲黏膜組（P＜0.05），原因?yàn)檎顟B(tài)下，Pin1通常呈低表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞惡變后，其表達(dá)上調(diào)，并導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，細(xì)胞增殖速度加快，促使腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在NIP中Pin1參與腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，并可能造成細(xì)胞周期出現(xiàn)紊亂，腫瘤細(xì)胞增殖加速，惡變風(fēng)險(xiǎn)增高。

mTOR最早在20世紀(jì)90年代初被發(fā)現(xiàn)，屬于磷酸肌醇3-激酶相關(guān)蛋白激酶家族成員，是一種位于PI3K/PKB信號蛋白通路下游的靶蛋白[15]。相關(guān)研究證實(shí)[16]，mTOR在多種惡性腫瘤細(xì)胞中存在異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，直接或間接控制細(xì)胞的生長、增殖及遷移等生物過程。本研究結(jié)果顯示，NIP組mTOR蛋白陽性率高于正常下鼻甲黏膜組（P＜0.05），這可能是因?yàn)閙TOR的過度表達(dá)會上調(diào)CyclinDl蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長周期發(fā)生紊亂，并可加速細(xì)胞的惡變。

本研究結(jié)果顯示，在NIP中Pin1和mTOR蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性，原因?yàn)镻in1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能，可與大部分酶類產(chǎn)生相互作用，加快細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與增殖[17]。mTOR屬于一種不典型蛋白激酶，參與細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞周期調(diào)控，調(diào)控細(xì)胞生長調(diào)節(jié)的核心歩驟，可與Pin1產(chǎn)生相互作用，在細(xì)胞周期中對細(xì)胞生長有重要作用，且兩者有一個(gè)共同的下游底物，即CyclinDl，從而在腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用，并可能是惡性細(xì)胞發(fā)生的重要因素，在NIP發(fā)生惡變的過程中起重要作用[18]。

綜上所述，Pin1和mTOR蛋白在NIP中高表達(dá)，通過有效抑制兩者的過表達(dá)，可能有望成為NIP靶點(diǎn)治療的新方向。