基于生物信息學(xué)方法分析頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵通路和樞紐基因

李先芳，林璋

（福建省老年醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建 福州350000）

頸動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病發(fā)生的主要因素，明確頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制是預(yù)防心腦血管的關(guān)鍵[1-3]，盡管影響頸動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)因素較多，但目前頸動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制尚未完全明確，因此，研究頸動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制具有重要意義。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及公共數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，利用生物信息學(xué)探索疾病的相關(guān)機(jī)制越來(lái)越普遍[4]。本研究利用生物信息學(xué)和GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，獲得頸動(dòng)脈斑塊與斑塊旁組織的差異基因（differentially expressed genes，DEGs)，并利用GO和KEGG對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析，同時(shí)利用PPI網(wǎng)絡(luò)和cytoscape技術(shù)篩選差異基因的樞紐基因，探索經(jīng)頸動(dòng)脈粥樣硬化潛在的治療靶點(diǎn)，為心腦血管疾病的早期預(yù)警奠定一定的理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 差異基因的篩選 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析GSE43292數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集含有32例頸動(dòng)脈粥樣斑塊組織和32例斑塊旁組織，利用GEO2R在線工具分析獲得DEGs，利用R語(yǔ)言進(jìn)行火山圖繪制。

1.2 GO和KEGG分析GO富集分析是按照生物學(xué)進(jìn)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）進(jìn)行富集調(diào)查的方法，對(duì)基因功能進(jìn)行注解；KEGG是將基因按照所在生物學(xué)通路進(jìn)行富集分析。利用R語(yǔ)言包c(diǎn)lusterprofile對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和樞紐基因的篩選 蛋白互作（proetin-protein interaciton，PPI）網(wǎng)絡(luò)是用于預(yù)測(cè)和分析蛋白之間的潛在相互作用，利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（https://string-db.org/cgi/input.pl），將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入cytoscape軟件，利用cytohubba篩選樞紐基因。

2 結(jié)果

利用GEO2R分析GSE43292共獲得97個(gè)DEGs，包括46個(gè)上調(diào)DEGs和51個(gè)下調(diào)DEGs，所獲結(jié)果可視化為火山圖，見(jiàn)圖1。

圖1 GSE43292的火山圖Figure 1 Volcano map of GSE43292

2.1 差異表達(dá)基因的GO功能富集及KEGG通路分析 利用R語(yǔ)言對(duì)97個(gè)DEGs進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析，按富集基因數(shù)目排序，分別取位于前10的分析結(jié)果。GO功能注釋結(jié)果顯示：在生物學(xué)過(guò)程中，DEGs主要涉及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、平滑肌細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、吲哚烷基胺代謝過(guò)程等，見(jiàn)圖2；在細(xì)胞組分中，DEGs主要與細(xì)胞外基質(zhì)、受體復(fù)合物和細(xì)胞膜面有關(guān)，見(jiàn)圖3；在分子功能上，DEGs主要涉及碳水化合物結(jié)合、酰胺鍵、金屬內(nèi)肽酶活性等。KEGG通路分析顯示，DEGs主要富集cAMP信號(hào)通路、色氨酸代謝、PPAR信號(hào)通路等相關(guān)通路，見(jiàn)圖4～5。

圖2 差異基因的GO注釋功能生物學(xué)過(guò)程分析Figure 2 The biological process of GO analysis

圖3 差異基因的GO注釋功能細(xì)胞組分分析Figure 3 The cellular component of GO analysis

圖4 差異基因的GO注釋功能分子功能分析Figure 4 The molecular function of GO analysis

圖5 差異基因的KEGG富集通路分析Figure 5 KEGG pathway analysis

2.3 PPl網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及樞紐基因建立 將97個(gè)DEGs的String蛋白互作分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖6，然后在MCODE插件中找出得分最高的蛋白互作模塊，最后在cytoHubba插件中利用MCC法篩選MMP9、CXCL10、CD163和CCR1等5個(gè)樞紐基因，見(jiàn)圖6。

圖6 差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 6 PPI netwolk of DEGs

3 討論

本研究利用生物信息學(xué)分析技術(shù)對(duì)頸動(dòng)脈斑塊組織和斑塊旁組織進(jìn)行分析，共獲得97個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因46個(gè)，下調(diào)基因51個(gè)。DEGs可能與頸動(dòng)脈斑塊的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[5-6]。KEGG基因富集分析發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展可能與cAMP信號(hào)通路、色氨酸代謝、PPAR信號(hào)通路等有關(guān)[7]。PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選出CD163、MMP9、CXCL10、CCR1為樞紐基因，可能在動(dòng)脈粥樣斑塊進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用[8-9]。

CD163為清道夫受體半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域家族成員，其通常在單核巨噬細(xì)胞膜上表達(dá)，通過(guò)調(diào)控炎癥因子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，與清道夫的功能相關(guān)[10-11]。而清道夫是與頸動(dòng)脈斑塊的危險(xiǎn)因素。MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，是一種基質(zhì)溶解素。大量研究表明，血清MMP-9與頸動(dòng)脈粥樣硬化性斑塊形成及其穩(wěn)定性密切相關(guān)[12-13]。動(dòng)脈粥樣硬化初期，激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CXCL10粘附分子，發(fā)揮粘性趨化炎性細(xì)胞的滲入，隨著血小板的轉(zhuǎn)移，炎性細(xì)胞隨之滲入血管壁和血管平滑肌細(xì)胞，所以在動(dòng)脈粥樣硬化中至關(guān)重要[14-15]。迄今為止，動(dòng)脈粥樣硬化的潛在機(jī)制未完全清楚，但其重要環(huán)節(jié)中均發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞的局部浸潤(rùn)及CXCL10的表達(dá)量增加[16-17]。CCR1即趨化因子C-C基元受體1，該基因編碼β趨化因子受體家族的成員，此受體有7個(gè)跨膜區(qū)，而其與正常T淋巴細(xì)胞的分泌、單核細(xì)胞趨化蛋白3（MCP3）以及骨髓祖細(xì)胞抑制因子-1（MPIF）均有關(guān)，影響巨噬細(xì)胞的功能[18]。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的相關(guān)通路變化，為頸動(dòng)脈斑塊發(fā)生機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，本研究篩選的樞紐基因，可能成為頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的潛在治療靶點(diǎn)。