小鼠腹膜炎模型下血小板的生物學特征及其轉錄組變化

孫志強, 夏美娟, 鄭琳, 趙晶晶, 蘇培, 王洪濤, 周家喜, 劉翠翠

中國醫學科學院血液病醫院(中國醫學科學院血液學研究所), 北京協和醫學院, 實驗血液學國家重點實驗室, 國家血液系統疾病臨床醫學研究中心, 天津 300020

血小板是血液系統中體積最小的血細胞，直徑約2～3 μm[1]，在機體止血和血栓中發揮重要作用[2]。近年來，血小板的免疫功能逐漸被研究者們發現并得到驗證[3]。據報道，血小板參與炎癥[4]、自身免疫病[5]和抗細菌/病毒感染[6-8]等多種免疫應答過程，可通過黏附清除病原體[9]、分泌活性物質[10]、與免疫細胞相互作用[11]和抗原加工與提呈[12]等多種途徑發揮免疫調控作用。例如，在外源性感染早期，血小板可以通過與白細胞相互作用，尤其是中性粒細胞，加快中性粒細胞向感染部位募集[13]；血小板與中性粒細胞聚集體的形成，有助于調節和誘導中性粒細胞的免疫功能[14-15]。

雖然沒有細胞核，但是血小板的胞質內仍含有種類豐富的RNA，介導血小板的多種功能[16]。隨著RNA測序的快速發展，血小板的轉錄組分析在血小板生物學研究中的應用也越來越廣泛。目前，血小板在不同疾病狀態下的轉錄組變化已經有部分研究報道，包括膿毒血癥[17]、心肌梗塞[18]、病毒感染[19]等。例如，Middleton等[17]通過對膿毒血癥患者和小鼠模型的血小板進行轉錄組測序發現，表面黏附分子CD41蛋白編碼基因ITGA2B(integrin subunit alpha 2b)在膿毒血癥的血小板中顯著上調，并與患者死亡率增加相關。Campbell等[20]通過對健康人和登革熱病人的血小板進行轉錄組測序也發現，炎癥相關基因IFITM3(interferon induced transmembrane protein 3)在登革熱病人的血小板中高表達，其表達水平與患者病情的嚴重程度和死亡率高度相關。因此，解析血小板的轉錄組變化不僅可以加深對于血小板本身生物學功能及其潛在分子機制的理解，而且在臨床疾病的診斷與病情評估中也有極大的應用價值。

急性感染模型是研究炎癥狀態下免疫細胞數量與功能變化的重要工具，能為臨床上急性炎癥治療提供理論指導與支撐[21]。為了研究急性感染條件下免疫細胞和血小板的變化，本研究首先通過小鼠腹腔注射熱滅活的大腸桿菌，構建了小鼠腹膜炎急性感染模型；同時借助血常規、流式細胞術等實驗技術，對感染過程中腹腔免疫細胞和外周血細胞進行動態檢測；最后，通過RNA-Seq解析感染后小鼠血小板轉錄組的表達變化。本研究有助于加深對急性感染過程中機體免疫應答的認知，旨在為解析血小板免疫調節功能的分子機制提供新的角度。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

獸用血細胞分析用稀釋液購自深圳mindray公司；臺式液購自廣州沛瑜生物制品有限公司；Trizol購自美國Thermo Scientific公司；本研究中所用抗體均購自美國BioLegend公司。

1.2 實驗儀器

CantoⅡ流式細胞儀(美國BD公司)；NanoDrop 2000(美國Thermo Scientific公司)；BC-5000Vet血細胞分析儀(深圳mindray公司)；Multiskan GO酶標儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 實驗動物

8周齡的C57BL/6J雌鼠(SPF級別)由中國醫學科學院&北京協和醫學院血液病醫院(血液學研究所)實驗血液學國家重點實驗室動物中心購買并提供，所有的動物實驗操作都符合中國醫學科學院血液病醫院倫理委員會的規定與要求。

1.4 E.coli菌種培養與保存

用接種環取少量大腸桿菌Escherichiacoli(菌種19138；ATCC)菌液接種在LB固體培養基中活化，37 ℃孵箱恒溫培養18～24 h。挑取單個菌落置于4 mL LB液體培養基中進行二次活化，37 ℃、200 r·min-1培養10 h。取菌液和30%甘油按體積比1∶1混勻，置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 小鼠腹膜炎模型構建

取1.4中二次活化后的E.coli菌液，8 000 r·min-1離心2 min，棄上清。用生理鹽水洗滌2遍后重懸于1 mL生理鹽水中。取洗滌后的適量E.coli菌液與生理鹽水1∶5稀釋后用酶標儀測定吸光度(OD600)值并按照每0.1 OD值相當于1×108cfu·mL-1計算菌濃度。其余E.coli菌液置于80 ℃，高溫滅活30 min。根據測定的菌濃度將滅活的菌液用生理鹽水稀釋至1×107cfu·300 μL-1，冷卻至室溫后給每只小鼠腹腔注射300 μL。

1.6 小鼠腹腔細胞檢測

為了檢測腹膜炎條件下小鼠腹腔中巨噬細胞、中性粒細胞數目和比例的動態變化，脫頸法處死E.coli感染不同時間點(0、6、12、24、36、48、72 h)的腹膜炎模型小鼠，使用75%乙醇溶液浸泡1 min，用剪刀剪開小鼠腹部毛皮，用10 mL注射器吸取10 mL PE溶液，在腹正中線處進針，反復多次沖洗小鼠腹腔獲得腹腔細胞懸液，2 000 r·min-1離心5 min得到細胞沉淀，再用適量PBS溶液重懸。

利用血細胞分析儀對腹腔細胞重懸液進行血細胞分類與計數。同時，取腹腔細胞重懸液，按抗體說明書要求加入適量抗小鼠CD45、抗小鼠CD11b、抗小鼠Ly6G、抗小鼠F4/80抗體，4 ℃標記30 min。標記結束后，加入1 mL PBS溶液，2 000 r·min-1離心5 min，洗去未結合的抗體，適量PBS溶液重懸后用CantoⅡ儀器進行流式檢測。

1.7 小鼠外周血血細胞檢測

為了檢測腹膜炎條件下小鼠外周血中單核細胞、中性粒細胞和血小板數目的動態變化，取腹膜炎模型小鼠造模后不同時間點(0、6、12、24、36、48、72 h)的內眥靜脈血20 μL，加入到480 μL血細胞稀釋液中，渦旋混勻，使用血細胞分析儀預稀釋模式檢測小鼠外周血血細胞分類與計數。

1.8 血小板分離與純化

取腹膜炎模型小鼠和注射等量生理鹽水的對照小鼠造模后36 h的下腔靜脈血800～1 000 μL，加入等體積生理鹽水稀釋混勻，1 000 r·min-1離心5 min(5升5降)。取富含血小板的上層液體并轉移至新的EP管中，3 500 r·min-1離心2 min。棄上清，加入CGS溶液(pH 6.5)重懸，2 500 r·min-1離心2 min，洗滌2遍。棄上清，加入臺式液重懸，靜置1 h，得到純化后的血小板(純度大于99.9%)。

1.9 轉錄組分析

取腹腔注射生理鹽水和熱滅活E.coli的小鼠，在注射后36 h通過下腔靜脈取血，分離并純化血小板。使用Trizol裂解血小板，提取RNA。用NanoDrop 2000對RNA濃度進行測定和質控。RNA濃度(10～1 000 ng·μL-1)和質控合格(28S/18S≥1.0)的樣本送由諾禾致源公司進行轉錄組測序，測序樣本獨立重復3次。隨后，使用STAR(version 2.7.2a)軟件的默認參數對質控后的原始數據(fastq)進行基因組比對，從GENCODE中下載gencode.vM25作為小鼠的參考基因組。使用featureCounts(version 2.0.1)軟件的默認參數得到樣本的基因表達譜。對標準化后的基因表達譜進行非參數檢驗和計算倍數變化(foldchange, FC)。

1.10 血小板表面黏附分子表達水平檢測

為了檢測小鼠腹膜炎感染前后血小板表面黏附分子CD42d的蛋白表達水平，通過小鼠內眥靜脈取血并進行血小板純化，取純化后的血小板，按抗體說明書的要求加入抗小鼠CD41、抗小鼠CD42d抗體，室溫標記30 min。標記結束后，加入1 mL CGS溶液，2 500 r·min-1離心2 min，洗去未結合的抗體，適量臺式液重懸后用CantoⅡ儀器進行流式檢測。

1.11 數據統計

使用FlowJoV10軟件對流式檢測數據進行分析，實驗數據使用GraphPad Prism8進行統計分析和作圖。實驗數據用Mean±SD表示，利用標準t檢驗對實驗數據進行分析，其中P<0.05則認為數據差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 感染過程中腹腔和外周血中免疫細胞檢測

為了研究免疫細胞和血小板在急性炎癥條件下的潛在作用，通過注射熱滅活的大腸桿菌(1×107cfu·只-1)構建了小鼠腹膜炎模型。巨噬細胞與中性粒細胞是固有免疫細胞的重要組成部分，基于小鼠腹膜炎模型，首先檢測了感染過程中腹腔內巨噬細胞(CD45+CD11b+F4/80+)和中性粒細胞(CD45+CD11b+Ly6G+)比例的動態變化，結果發現腹腔內巨噬細胞的比例在感染后6 h急劇降低至最低值，并持續保持該低水平，直至72 h開始回升。而腹腔內中性粒細胞的比例則在感染后6 h快速升高，12 h到達最高值，之后逐漸降低，在72 h大致恢復到正常水平(圖1A)。進一步細胞計數發現，腹腔內巨噬細胞和中性粒細胞的數目與比例變化基本一致(圖1B～1C)。外周血細胞動態檢測發現，單核細胞數目在感染后24 h開始顯著增加，在感染后期達到并維持在最大值，這可能與感染后期小鼠腹腔巨噬細胞數目的回升有關(圖1D)。而外周血中性粒細胞數目在感染后6 h迅速增加，12 h達到最大值，之后開始逐漸減少，這與小鼠腹腔內中性粒細胞數目的變化趨勢相一致(圖1E)。上述結果提示，在感染初期，腹腔內巨噬細胞最先發揮殺菌作用，隨后外周中性粒細胞快速遷移至腹腔參與炎癥反應。

A:小鼠腹膜炎模型感染過程中腹腔內CD45+細胞中巨噬細胞和中性粒細胞比例動態變化流式分析，巨噬細胞：CD45+CD11b+F4/80+，中性粒細胞：CD45+CD11b+Ly6G+；B:小鼠腹膜炎模型感染過程中腹腔內巨噬細胞數目的動態變化，每個時間點3只小鼠；C:小鼠腹膜炎模型感染過程中腹腔內中性粒細胞數目的動態變化，每個時間點3只小鼠；D:小鼠腹膜炎模型感染過程中外周血單核細胞數目的動態變化，每個時間點5只小鼠；E:小鼠腹膜炎模型感染過程中外周血中性粒細胞數目的動態變化，每個時間點5只小鼠。*，**，***分別表示處理在P<0.05、P<0.01、P<0.001水平差異有統計學意義；NS表示無統計學差異(P>0.05)。

2.2 感染過程中外周血血小板檢測

隨后，為了研究腹膜炎急性感染對小鼠血小板生物學特征的影響，進一步探究了血小板的數目、大小在急性感染過程中的動態變化。血常規檢測發現，血小板數目在感染后6 h內大幅降低(下降約50%)，在24 h降至最低，之后逐漸升高，72 h后恢復到正常水平(圖2A)。此外，平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)和血小板分布寬度(platelet distribution width，PDW)則在感染后呈現升高趨勢，說明感染后血小板體積增大且均一性降低(圖2B～2C)。上述結果表明，在急性感染過程中血小板的數目和大小會發生顯著變化，可能預示著血小板轉錄組和生物學功能的改變。

A:小鼠腹膜炎模型感染過程中外周血血小板數目的動態變化；B:小鼠腹膜炎模型感染過程中外周血血小板MPV的動態變化；C:小鼠腹膜炎模型感染過程中外周血血小板PDW的動態變化。每個時間點5只小鼠。*，**，***，****分別表示處理在P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1水平差異有統計學意義；NS表示無統計學差異(P>0.05)。

2.3 感染前后血小板轉錄組分析

為了進一步研究感染前后血小板的轉錄組變化，分別收集了對照組和感染小鼠的純化血小板(純度大于99.9%)進行了RNA-Seq。通過對兩組6個測序樣本進行主成分分析(principal component analysis, PCA)，發現對照組和實驗組的3個血小板樣本組內變異小，但組間具有明顯差異(圖3A)。差異基因分析發現，3 725個編碼基因在感染組血小板中顯著上調(P<0.05, 上升倍數≥2)，僅108個基因在感染后明顯下降(P<0.05, 下降倍數≥2)(圖3B)。為了進一步研究急性感染中血小板轉錄組變化的生物學意義，首先對感染組表達上調的基因進行Gene Ontology(GO)分析。結果表明，這些基因顯著富集于中性粒細胞脫顆粒、中性粒細胞介導的免疫和中性粒細胞激活等基因集(圖3C)。Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)分析發現，與對照血小板相比，白細胞跨內皮遷移(NES=1.51,P=0)相關基因顯著富集在感染組血小板中(圖3D)。上述結果提示，在急性感染過程中，血小板可能通過促進白細胞遷移、中性粒細胞激活等過程參與免疫應答。

A:對照小鼠和腹膜炎模型小鼠外周血血小板轉錄組PCA，由3次獨立重復實驗得到6個血小板RNA樣本；B:對照小鼠和腹膜炎模型小鼠血小板中的差異基因火山圖(Volcano Plot)(E.coli vs control：腹膜炎小鼠 vs 對照小鼠)，Up表示表達水平上調的基因(P<0.05，FC≥2)，Down表示表達水平下調的基因(P<0.05，FC≤0.5)，NS表示表達水平無顯著差異的基因(P<0.05，0.5

2.4 感染后血小板表面黏附分子表達水平檢測

血小板表面黏附分子在血小板與中性粒細胞等白細胞的相互作用中發揮重要作用[22]。為了進一步探討血小板促進白細胞遷移的潛在分子機制，對比了兩組血小板中表面黏附分子的表達變化(P<0.05, 上升倍數≥2)。分析發現，人血管性血友病因子vWF、血小板內皮細胞粘附分子-1(Pecam1，CD31)、L-選擇素(Sell，CD62L)、P-選擇素(Selp，CD62P)等介導血小板與白細胞或內皮細胞黏附的關鍵因子均在感染后顯著上調(圖4A)。而且，Itga2b(CD41)、Gp5、Gp1ba和Gp1bb(CD42d/b/c)等黏附分子經典受體基因的表達也明顯升高(圖4A)。為了進一步檢測上述表面黏附分子的蛋白表達水平，選取了表達豐度和差異倍數均較高的CD42d進行流式檢測。分析發現，與對照組相比，感染36 h后血小板CD42d的平均熒光強度顯著增強(圖4B)。而且，感染36 h后CD42dhigh血小板的比例也顯著升高(圖4C～4D)。上述結果提示，急性炎癥條件下，血小板可能通過高表達多種表面黏附分子促進白細胞遷移，從而參與調節免疫反應。

A:對照小鼠(Control)和腹膜炎模型小鼠(E.coli)血小板中表面黏附分子的表達分析熱圖(Heatmap)；B:對照小鼠和腹膜炎模型小鼠血小板中黏附分子CD42d的平均熒光強度(MFI)流式結果統計分析；C:對照小鼠和腹膜炎模型小鼠中CD42dhigh血小板比例流式檢測結果；D:對照小鼠和腹膜炎模型小鼠CD42dhigh血小板比例統計分析。流式分析驗證中對照小鼠和腹膜炎模型小鼠各5只。*和***分別表示在P<0.05和P<0.001水平差異有統計學意義。

3 討論

本研究基于小鼠腹膜炎急性感染模型，對免疫細胞和血小板在急性感染過程中的動態變化進行了細致的檢測與分析。研究發現，在感染早期外周血中性粒細胞能快速遷移至腹腔參與炎癥反應，外周血血小板數目和大小在感染過程中發生顯著變化。進一步對血小板轉錄組進行RNA測序，分析發現腹膜炎模型小鼠的血小板轉錄組發生了顯著改變，血小板中免疫反應相關基因在感染后顯著上調，多種表面黏附分子的表達顯著增加，血小板的免疫功能顯著增強。

轉錄組測序技術是生物學研究中的重要工具。目前，血小板轉錄組測序在一些特定疾病條件下已有相關研究報道[16]，這些研究極大地推動了血小板領域的發展，拓展了研究者們對血小板功能的認知，尤其是血小板的免疫功能。本研究通過對腹膜炎模型小鼠的血小板進行轉錄組測序，不僅為血小板研究領域提供了小鼠腹膜炎條件下血小板的轉錄圖譜，而且為血小板免疫功能及作用機制的深入研究奠定了基礎。

血小板的免疫功能多樣，在機體固有免疫與適應性免疫應答中都發揮著重要作用。并且在不同疾病條件下，血小板參與免疫反應的分子機制也不盡相同。激活的血小板可以通過膜表面表達的P選擇素(P-selectin)與白細胞表面的P選擇素糖蛋白配體(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)相互作用，調節白細胞外滲、吞噬作用和細胞因子轉錄與釋放等生物學功能[22]。血小板能和中性粒細胞形成聚集體，調節中性粒細胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)、中性粒細胞細胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)的產生與釋放[14-15]。血小板表面受體分子在介導血小板抗感染和免疫反應中發揮重要作用，其中表面黏附分子CD41[23]、CD42[24]、P-selectin[25]和CD31[26]等在血小板聚集黏附、白細胞募集過程中尤為關鍵。本研究通過對血小板轉錄組測序數據進行生物信息學分析發現，腹膜炎急性感染后小鼠血小板的轉錄組發生了顯著改變，大量免疫反應相關的基因以及多種介導血小板與白細胞或內皮細胞黏附的受配體分子的表達顯著升高。上述結果提示，在急性炎癥條件下，血小板可能通過高表達多種表面黏附分子增強自身的免疫功能，從而更快更強地促進白細胞遷移和激活中性粒細胞，參與調節炎癥進程和免疫應答的過程之中。

總之，本研究對急性感染條件下血小板免疫調節功能的分子機制做了初步探索，但仍然存在許多有趣且重要的問題值得進一步研究。比如，急性感染條件下血小板免疫表型的改變，血小板與外周血其他免疫細胞相互作用的方式，血小板數量對腹膜炎急性感染進程的影響等。未來研究中對這些問題的解答，有助于深入了解血小板在腹膜炎等急性感染條件下的免疫調控機制，有望為急性感染患者的臨床診斷與治療提供新的思路和方法。