植物內質網脅迫研究進展

張融雪, 孫玥, 蘇京平, 王勝軍, 劉燕清, 佟卉, 孫林靜

天津市農作物研究所, 天津市農作物遺傳育種重點實驗室, 天津 300384

內質網具有很多重要的功能，如參與蛋白質合成的折疊、組裝、轉運、分泌以及糖基化等，其中最為重要的功能之一就是對蛋白質的質量控制。內質網中存在精確的內質網質量控制系統(endoplasmic reticulum quality control, ERQC)，正常條件下，分子伴侶和糖基化修飾能輔助蛋白質正確折疊，一些不正確折疊的蛋白質會被糖鏈標記后再次折疊[1]；如果持續不能正確折疊則會被輸出內質網，通過內質網相關降解(endoplasmic reticulum-associated degradation, ERAD)或自噬進行降解[2]。然而，在應激條件下，錯誤折疊和未折疊蛋白質大量產生而ERQC系統無法及時處理，錯誤折疊和未折疊蛋白質大量積累導致內質網脅迫(endoplasmic reticulum stress, ERS)，進而引發未折疊蛋白質響應(unfolded protein response, UPR)。UPR能夠調控一系列下游基因，如分子伴侶、ERAD組分等，如果這些調控還不能使植物內質網穩態恢復正常，UPR將會啟動細胞程序性死亡(program cell death, PCD)[3]。

酵母作為一種模式生物，被廣泛用于科學研究，酵母中的ERS和UPR等相關分子機制的研究已較為透徹[4]。在動物體系中，ERS的相關分子機制也己被深入探究，并發現其在神經性疾病和心血管疾病的治療中起到關鍵作用[5]。當植物遭受干旱、高溫、鹽等脅迫時，也會引發內質網脅迫，但目前，植物內質網脅迫方面的研究較酵母和動物滯后。因此，本文從內質網質量控制系統和未折疊蛋白質響應2個方面對植物內質網脅迫現有研究進行綜述，以期為進一步理解內質網脅迫和植物逆境脅迫的關系提供參考。

1 植物內質網質量控制系統

內質網是分泌蛋白和膜蛋白折疊與修飾的重要場所，存在嚴密的質量控制系統，該系統被稱為ERQC[2]。該系統主要作用包括通過分子伴侶和糖基化修飾幫助蛋白質正確折疊，利用ERAD和自噬清除錯誤折疊蛋白質來維持內質網穩態[3]。正常條件下，蛋白質折疊和錯誤折疊蛋白質清除之間存在著精確的平衡。

1.1 植物內質網分子伴侶

植物內質網中存在多種分子伴侶，能夠幫助蛋白質正確折疊。擬南芥中有3個重鏈結合蛋白基因(heavy-chain binding protein,BiP)，均受內質網脅迫誘導因子衣霉素誘導表達，BiP能夠結合內質網降解底物蛋白——油菜素內酯不敏感突變體1-5(brassinosteroid-insensitive 1-5, bri1-5)和bri1-9[6]；辣椒中有3個BiPs，分別是CaBiP1、CaBiP2和CaBiP3，其中CaBiP1和CaBiP2在正常和脅迫條件下均穩定表達，CaBiP3受脅迫誘導表達，CaBiP1的RNAi植株對多種脅迫敏感[7]。擬南芥內質網定位DNAJ家族成員3B(ER-localized DnaJ family 3B, ERdj3B)是DNAJ/HSP40(heat shock protein 40)同源物，能夠與BiP結合參與ERQC。謝非德基因(SHEPHER, SHD)是葡萄糖調節蛋白94(glucose-regulated protein 94, GRP94)的同源物，具有分子伴侶功能，受內質網脅迫誘導因子衣霉素和二硫蘇糖醇強烈誘導[8]，對其突變體分析發現SHD是克拉瓦塔蛋白(CLAVATA, CLV)合成的必要條件[3,9]。內質網滯留的蛋白質二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase, PDI)也是分子伴侶，擬南芥中有13個內質網滯留的PDI類蛋白[10]，目前還沒有直接證據表明PDI與錯誤蛋白質清除有關，但ERAD底物bri1-5的Cys62Tyr突變體能被滯留于內質網，暗示PDI可能與內質網錯誤蛋白質的清除有關[11]。

1.2 植物CNX/CRT循環

外源凝集素鈣聯蛋白(calnexin, CNX)是內質網定位的單次跨膜蛋白，N末端有凝集素結構，能夠結合糖蛋白葡萄糖殘基，C末端含有跨膜域。鈣網蛋白(calreticulin, CRT)是內質網腔可溶性蛋白，N末端結構與CNX類似，而C末端無跨膜域但有內質網滯留信號。CNX和CRT都是凝集素類蛋白，能特異識別并結合葡萄糖基1-甘露糖基9-葡萄糖胺2(Glc1Man9GlcNAc2)修飾，還能夠招募其他分子伴侶幫助被上述糖基修飾的蛋白質折疊。折疊正確的糖基化蛋白質在葡萄糖苷酶Ⅱ的作用下去除Glc1Man9GlcNAc2的Glc，使CNX/CRT對糖基親和力下降并解離下來；折疊不完全的蛋白質由尿苷二磷酸葡萄糖糖蛋白糖基轉移酶(UDP-glucose:glycoprotein glucosyl-transferase，UGGT)催化Man9GlcNAc2又生成Glc1Man9GlcNAc2，進入CNX/CRT循環[12]。擬南芥中有3個鈣網蛋白CRT和2個鈣聯蛋白CNX，N末端球型結構、脯氨酸豐富的P結構域和C結構域是二者共同點，不同之處在于P結構域和C結構域之間是否有跨膜域，CNX有該跨膜域而CRT沒有。二者N末端均可結合單葡糖基修飾的低分子聚糖，并且存在保守的KHEQKLDCGGGYVLL和IMFGPDICG序列[13]。植物CRT的另一個特征是N末端有潛在糖基化位點，但是沒有高甘露糖低分子聚糖修飾。bri1-9是功能完整但是部分結構有變異的油菜素內酯受體，能被AtCRT3結合從而滯留在內質網，但是在atcrt3 bri1-9雙突變體中，沒有AtCRT3可結合的bri1-9又能正常轉運出內質網，從而恢復了突變體對油菜素內酯(brassinosteroids, BR)的敏感性，但AtCNX沒有滯留bri1-9于內質網的功能[14]。同時有研究表明，UGGT突變也能讓bri1-9逃逸出內質網，當UGGT缺失時，bri1-9雖然沒有正確折疊但也不能被糖基化，所以不必進入CNX/CRT循環，會被當做正常的蛋白質直接轉運出內質網[15]。

1.3 植物糖基化修飾

真核生物的內質網和高爾基體中會發生N端糖基化，Asn-X-Ser/Thr被稱為糖基化位點，此類糖基化由寡糖基轉移酶(oligosaccharyl transferase, OST)完成，衣霉素阻斷此過程可導致低聚糖鏈無法正確連接到初生蛋白，缺乏糖基化修飾的初生蛋白不能被分子伴侶識別而形成未折疊蛋白，進一步導致內質網脅迫[16]。

N端糖基化的質量檢測由Ⅰ類α-甘露糖苷酶(alpha-mannosidase Ⅰ, MNS)控制。擬南芥中有5個MNS，分別是MNS1、MNS2、MNS3、MNS4和MNS5。其中，MNS1和MNS2定位于高爾基體，MNS3、MNS4和MNS5定位于內質網。MNS3將Man9GlcNAc2切除1個甘露糖殘基后形成Man8GlcNAc2，MNS1/2繼續剪切3個α-1,2甘露糖殘基。MNS4和MNS5是降解bri1-5和bri1-9所必需的，而MNS1、MNS2和MNS3不參與降解過程[16]。當糖蛋白未折疊完全或者錯誤折疊，UGGT可催化這些蛋白質重新糖基化[17]。

1.4 植物內質網相關降解

無法恢復正確折疊的糖蛋白會被轉運出內質網通過26S蛋白酶體降解，被稱為ERAD。植物中已報道的ERAD相關底物有擬南芥BR受體突變蛋白bri1-5和bri1-9[18]、擬南芥液泡羧肽酶Y277位甘氨酸突變精氨酸蛋白(arabidopsis carboxypeptidase Y*glycine 277 arginine, AtCPY*-G277R)[19]、大麥抗白粉病基因1(barley powdery mildew O 1, MLO-1)和MLO-12[20]、蓖麻毒蛋白A鏈(ricin toxin A chain，RTA)[21]和蓖麻凝集素(ricinus communis agglutinin，RCA)[22]。

底物識別方面，AtOS9含有甘露糖6磷酸鹽受體同源結構域(mannose-6 phosphate receptor homology, MRH)，能識別C 鏈末端α-1,6甘露糖殘基。在功能缺失突變體atos9中，bri1-5和bri1-9的表型可被抑制。AtOS9能與羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解因子3A(hydroxymethyl glutaryl-coenzyme A reductase degradation 3A, HRD3A)相互作用，二者的功能缺失突變體均對鹽脅迫敏感，表明AtOS9和HRD3A均參與了植物糖蛋白的降解[23-24]。

底物轉運方面，酵母與哺乳動物中推測的轉運因子是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解因子1(hydroxymethyl glutaryl-coenzyme A reductase degradation 1, Hrd1)、內質網降解1(degradation in the ER, Der1)和Sec61[25]。擬南芥中,Hrd1的同源物有2個(AtHrd1A、AtHrd1B)，Der1的同源物有3個(DER1、DER2.1、DER2.2)，Sec61的同源物有3個(AT2G34250、AT1G29310、AT1G78720)；玉米中Der1的同源物有4個(ZmDer1-1、ZmDer1-2、ZmDer2-1、ZmDer2-1)，ZmDer1和ZmDer2能互補酵母Δder1的表型[26]。這也表明不同物種之間ERAD作用機制是保守的。

底物泛素化方面，AtHRD1A和AtHRD1B是定位于內質網的E3泛素連接酶，參與了bri1-5和bri1-9的降解，二者的單個缺失突變體對bri1-5和bri1-9均無影響，只有二者同時突變才有影響[27]。Matα2降解子10(degradation of Matα2 10, Doa10)是酵母中定位于內質網的泛素連接酶，擬南芥中的同源物叫做無蠟質9(eceriferum 9, CER9)或者干旱缺陷抑制子(suppressor of DRY2 defects 1, SUD1)，負調控脫落酸(abscisic acid, ABA)和蠟質合成從而負調控耐旱性[28]，還能夠通過調節甲羥戊酸途徑中的關鍵因子HMGR的活性影響甾醇類和異戊二烯類物質的合成[29]。膜錨定環指蛋白1(RING-finger protein with membrane anchor 1, RMA1)是動物細胞中又一個定位于內質網的泛素連接酶。擬南芥中有3個同源物：AtRMA1、AtRMA2和AtRMA3，三者也都定位于內質網，并且具有體外泛素連接酶活性[30]；辣椒中RMA1的同源物是CaRma1H1，通過降解水通道蛋白PIP2;1正調控轉基因擬南芥的抗旱性[31]；苜蓿中RMA1的同源物是MKB1，通過負調控羥甲基戊二酰輔酶A還原酶影響甾醇類物質合成[32]。黃花苜蓿鹽和衣霉素誘導環指蛋白1(Medicagofalcatasalt tunicamycin-induced RING finger protein, MfSTMIR)是1個跨膜域和1個C3H2C3類型RING結構域的E3泛素連接酶，定位于內質網，表達受鹽、干旱和衣霉素誘導。過表達MfSTMIR的擬南芥和苜蓿鹽脅迫耐受性增強。進一步研究表明，MfSTMIR能與內質網定位的泛素結合酶MtUBC32以及內質網蛋白轉運通道亞基MtSec61γ相互作用，促進ERAD相關底物MtCPY*的降解，以ERAD方式清除內質網錯誤折疊蛋白質來緩解鹽脅迫對植物的損害[33]。底物泛素化不僅需要泛素連接酶還需要E2泛素結合酶，植物中參與ERAD的E2目前只有AtUBC32，其表達受到衣霉素和鹽脅迫誘導，但是其缺失突變體對衣霉素和鹽脅迫均不敏感，AtUBC32能與AtDoa10相互作用，調控bri1-5和bri1-9的降解過程[20]。

底物降解方面，細胞分裂調控蛋白48(cell division control protein 48, CDC48)是AAA(ATPases associated with diverse cellular activities)型ATP水解酶，在煙草葉肉細胞中是降解RTA和RCA所必需的[34]。無ATPase活性的CDC48A-QQ能穩定MLO-1。酵母中與ERAD相關的Ubx2、Rad23在植物中也有同源物，但是在ERAD方面的具體功能尚未報道[35]。

植物內質網降解系統還包含其他組分。甲基磺酸乙酯誘變油菜素內酯不敏感突變體1抑制因子7(ethyl methanesulfonate-mutagenized brassino-steroid insensitive 1 suppressor 7,EBS7)編碼一種植物特異性的內質網定位蛋白，與ERAD組分AtHRD1a相互作用，并可能調節HRD1a的穩定性。在ebs7 bri1-9中，EBS7的缺失使得AtHrd1a穩定性下降，從而導致bri1-9多聚泛素化水平下降，增加了bri1-9的穩定性，部分恢復了ebs7 bri1-9的BR敏感性[36]。Hrd1-1相關蛋白1(protein associated with Hrd1-1, PAWH1)和PAWH2定位于內質網膜上，并且與EBS7直接互作。在ebs7突變體中,PAWH1和PAWH2的蛋白質穩定性下降，pawh1 pawh2雙突變體中EBS7和HRD1穩定性下降，對內質網脅迫和鹽脅迫的敏感性增強[37]。

1.5 植物內質網自噬

在內質網脅迫條件下，內質網特定區域能通過自噬進行降解和循環，這也是質量控制的一部分，植物中UPR和內質網自噬緊密相關[38]。內質網脅迫感受器IRE1B通過降解自噬基因表達抑制因子的轉錄本間接促進自噬，從而將自噬與內質網脅迫聯系起來[39]。自噬相關基因9(autophagy related 9, ATG9)對植物中內質網脅迫引起的自噬體形成至關重要，在atg9突變體自噬相關蛋白中ATG18a的轉運被破壞[40]。上述結果表明自噬在清除受損內質網膜、錯誤折疊蛋白質方面有重要作用。

2 植物未折疊蛋白質響應

當植物遭受干旱、高溫、鹽等脅迫時，會引起內質網脅迫。內質網脅迫能夠引發UPR。哺乳動物中有3條經典UPR通路：肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1, IRE1)-X盒結合蛋白1(X-box-binding protein 1, XBP1)、轉錄激活因子6(activating transcription factor 6, ATF6)-位點2蛋白酶(site-2 proteases, S2P)、蛋白激酶樣內質網激酶(PKR-like ER Kinase, PERK)-轉錄激活因子4(activating transcription factor 4, ATF4)[41]。在植物中，IRE1-bZIP60通路對應IRE1-XBPl，bZIP17/bZIP28-S2P通路對應ATF6-S2P，目前尚未發現PERK在植物中的對應通路[3]。UPR下游調控基因一般為幫助蛋白質折疊的分子伴侶和清除錯誤蛋白質的ERAD組分，脅迫嚴重時會引發PCD相關基因表達[3]。

2.1 植物未折疊蛋白響應信號感知

IRE1是內質網脅迫感受器，在擬南芥中存在2個同源物IRE1A和IRE1B，N末端在內質網腔內具有感受結構域，中間有1個跨膜結構，C末端是激酶和核糖核酸酶結構域[42]。擬南芥中IRE1的靶基因是AtbZIP60，正常條件下AtbZIP60定位于內質網外膜。內質網脅迫能活化IRE1，AtbZIP60mRNA被活化的IRE1剪切導致跨膜域移碼缺失，編碼產物不再定位于內質網而是進入細胞核發揮轉錄因子作用[43]。這種可變剪接在ire1a和ire1b中均能檢測到，但是在ire1a ire1b雙突變體中卻消失了，表明IRE1A和IRE1B在剪接AtbZIP60mRNA的功能上存在冗余性。AtbZIP60突變體中許多內質網脅迫相關基因表達與野生型相比顯著降低，AtbZIP60還能誘導自身表達[44]。水稻中OsIRE1對OsbZIP74也有這種可變剪接的作用，不僅去除了跨膜域，而且還產生了新的核定位信號[45]。此外，AtbZIP28或AtbZIP60能與轉錄起始復合物組分Ash2或WDR5a相互作用，對靶基因啟動子附近組蛋白H3K4me3水平進行調控，從表觀層面調控目的基因表達[46]。

圖1 植物UPR途徑及ERAD系統[2,47]

ATF6是另一個內質網脅迫感受器，在擬南芥中的同源物是AtbZIP17和AtbZIP28，正常條件下均定位在內質網膜。脅迫條件下，高爾基體滯留蛋白酶S1P和S2P酶切AtbZIP17和AtbZIP28，使其進入細胞核發揮轉錄因子功能[48]。ATF6本身不具有結合CCACG box的活性，與NF-Y相互作用后才有順式作用元件結合活性。AtbZIP28能與NF-YA4、NF-YB3和NF-YC2相互作用后行使基因表達調控功能，NF-YA、NF-YB和NF-YC之間也存在功能冗余[49]。AtbZIP17缺失突變體中鹽響應基因ATHB-7表達量下調，對鹽脅迫敏感；AtbZIP28突變體對鹽脅迫不敏感，但對高溫、衣霉素、二硫蘇糖醇敏感[50]。在擬南芥中過表達ZmbZIP17增強了轉基因擬南芥對衣霉素和二硫蘇糖醇的抗性，還增強了對ABA的敏感性[51]。擬南芥bZIP28和bZIP60在熱擊脅迫下共同調控了一些UPR響應基因的上調表達。bzip28bzip60雙突變體對熱脅迫敏感，角果長度和育性均降低[52]。ZmbZIP60通過激活HSFTF13上調HSP基因表達，增強玉米耐熱性，缺失突變體Zmbzip60在高溫條件下不能誘導HSP上調表達，弱化了高溫熱擊反應，導致突變體耐熱性降低[53]。

還有一些植物特異的膜定位轉錄因子也受內質網脅迫誘導表達，參與內質網脅迫相關基因的表達調控。NAC062定位于質膜，受衣霉素和二硫蘇糖醇誘導表達，并且能從質膜解離下來進入細胞核，AtbZIP60缺失影響NAC062表達。NAC062的RNAi植株中，僅有部分內質網脅迫相關基因表達受損，如SHD、BiP1/2和CRT1，而其他內質網脅迫相關基因BiP3、CNX1、PDI5和PDI6表達正常，這表明NAC062能夠調控的內質網脅迫相關基因較為特異[54]。NAC089是另一個定位于內質網的轉錄因子，內質網脅迫時NAC089能夠從內質網膜解離進入細胞核。NAC089受內質網脅迫上調表達，是AtbZIP28和AtbZIP60的直接下游。過量表達NAC089可以誘導PCD相關基因表達，但降低NAC089的表達卻增強了植物內質網脅迫耐受性[55]。

2.2 植物未折疊蛋白質信號傳遞

UPR上調表達基因的啟動子區域大部分有植物特異的順式作用元件Motif Ⅰ CCACGTCA和Motif Ⅱ CC-N12-CCACG，小部分有動物UPR順勢作用元件ERSE-Ⅰ和ERSE-Ⅱ，還有一些酵母UPRE；UPR下調表達的基因沒有發現保守的順勢作用元件[56]。擬南芥UPR信號途徑誘導表達的基因分為3類：①增強蛋白質折疊和轉運相關基因，如分子伴侶和囊泡運輸基因；②錯誤折疊蛋白質降解相關基因，如ERAD相關的泛素連接酶；③減少蛋白質合成相關基因，如抑制分泌蛋白表達基因。

UPR還調控了細胞凋亡相關基因。AGB1是G蛋白β亞基，ire1a ire1b abg1三突變體與ire1a ire1b雙突變體相比，對衣霉素更加敏感，但是BiP3、ERdj3A和ERdj3B的表達量在abg1中比野生型增加的多[57]。內質網脅迫和滲透脅迫誘導大豆脫水早期響應因子15(early responsive to dehydration 15,ERD15)表達，然后上調天冬氨酸豐富蛋白(N-rich protein,NPR)表達[58]。過表達NRP能夠促進細胞凋亡蛋白酶類似物Caspase-3Like表達，加速DNA片段化，進而導致大豆葉片衰老[59]。衣霉素誘導的擬南芥細胞凋亡初期，Bax抑制因子1(Baxinhibitor1,Bi1)表達量急劇增加，bi1突變體對衣霉素超敏感，而過量表達Bi1的轉基因擬南芥苗期對衣霉素不敏感，這表明Bi1在內質網脅迫誘導細胞死亡中起到關鍵作用。Bcl-2相關永生基因(Bcl-2-associated athanogene, BAG)是另一個抗凋亡因子，AtBAG7定位于內質網，與BiP2有相互作用，bag7缺失突變體對衣霉素更敏感[60]。

3 展望

內質網中的蛋白質折疊是真核細胞的一個重要過程，該過程受到內質網質量控制監測，內質網中異常折疊蛋白質的積累導致ERS，進而引發UPR，這一過程在酵母和哺乳動物細胞中研究較為詳細，而植物中研究較少。隨著ERAD和UPR關鍵組分在植物中得到確認，植物內質網脅迫研究逐漸深入，如HRD1和Doa10是哺乳動物細胞中構成ERAD復合體的核心泛素連接酶，在植物中分別是AtHRD1A/AtHRD1B和SUD1/CER9[28-29]；哺乳動物細胞中UPR通路IRE1-XBPl和ATF6-S2P，在植物中對應的分別是IRE1-XBPl和bZIP17/bZIP28-S2P[3]。除了上述保守組分，研究還發現了一些植物特異組分，如ERAD途徑相關的EBS7[36]、MfSTMIR[33]、PAWH1和PAWH2[37]，UPR途徑中的膜定位NAC轉錄因子NAC62[54]以及內質網定位的NAC089[55]，這些研究極大豐富了對植物內質網脅迫的認識。雖然植物內質網脅迫研究取得了長足的進步，但是仍存在一些問題，如Doa10在植物干旱反應中發揮作用，但其作用靶標尚未確定；哺乳動物細胞中UPR途徑的PERK/ATF4通路在植物中并未發現對應組分。因此，在植物內質網脅迫研究中還應關注以下幾方面：①內質網相關降解的底物鑒定研究需要加強，目前僅有CaRma1H1和SDIR1 的底物比較明確，其他內質網降解相關E3泛素連接酶的底物仍不清楚。②植物內質網脅迫相關的特異組分，例如EBS7、MfSTMIR等報道對環境脅迫有作用，但是尚未有其他特異組分報道。③關于內質網降解相關底物由內質網腔轉運至細胞質的過程在植物中仍不明確，具體組分不清楚。④植物UPR途徑組分研究相對較少，還有待發現更多組分并明確功能。