生物傳感器在食源性致病菌大腸桿菌O157∶H7檢測中的應用進展

白小蓮, 愛軍

內蒙古師范大學化學與環境科學學院，內蒙古自治區綠色催化重點實驗室，呼和浩特 010022

近年來，預防食源性致病菌污染的安全問題已成為當今世界性的公共衛生熱點。可引發食源性疾病的微生物種類繁多，其中，沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡葡萄球菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌是引發食物中毒的主要致病菌，嚴重威脅著人類的健康[1]。其中，腸出血性大腸桿菌O157∶H7是引發人類出血性結腸炎、溶血性尿毒癥、血栓性血小板減少性紫癜等疾病的一種致病因素[2]。受動物糞便污染的食物和水是大腸桿菌O157∶H7的主要來源，大腸桿菌O157∶H7的低劑量和高毒力往往使感染嚴重，危及生命，特別是對幼兒、老年人和免疫系統減弱的人[3]。自美國1982年首次爆發流行以來，世界上許多國家均相繼發生了大腸桿菌O157∶H7的感染流行，其中發病較多的國家主要有美國、加拿大和日本等[4-7]；我國自1986年首次報告大腸桿菌O157∶H7的感染病例以來，已先后有十幾個省市發現大腸桿菌O157∶H7感染的散發病例，存在潛在的流行威脅[8-9]。大腸桿菌O157∶H7感染具有高流行性、高發病率與病死率，因而受到國內外研究人員和世界各國衛生組織的廣泛關注。

開展致病菌的檢測是保障食品安全和公共衛生的重要手段。由此可見，只有對大腸桿菌O157∶H7進行及時的檢測和預防才能夠有效的避免大腸桿菌O157∶H7的感染，進而有效保障人們的健康。大腸桿菌O157∶H7中O是指O抗原，也就是體系細胞抗原，指包埋在細菌細胞壁中的脂多糖類；H是指H抗原，也稱之為鞭毛抗原，屬于蛋白質類，因其結構具有免疫能力。除常見的兩類抗原之外，還有K抗原、指莢膜抗原，大部分是多糖；還有M抗原，類似于粘蛋白、多糖類。主要通過這4類不同抗原類型來進行血清學上的分類來分析大腸桿菌[10]。大腸桿菌O157∶H7檢測方法相對豐富，主要方法包括傳統分離鑒定法、分子生物學法和免疫學法等，但是它們在使用上仍然存在耗時長、特異選擇性薄弱、靈敏度低等不確定性因素。隨著生物技術的發展，生物傳感器逐漸進入研究人員的視野。生物傳感器是一種對生物物質敏感并將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器，是由固定化的生物敏感材料作為識別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質)、適當的理化換能器(如氧電極、光敏管、場效應管和壓電晶體等)及信號放大裝置構成的分析工具或系統，具有接受器與轉換器的功能[11]。生物傳感器在致病菌檢測技術領域因具有效率高、特異性強等優點而取得了長遠的發展。基于此，本文對大腸桿菌O157∶H7的檢測方法及其演變進行了梳理和比較分析，并著重綜述了生物傳感器在大腸桿菌O157∶H7檢測中的應用進展，以期為大腸桿菌O157∶H7快速、準確和可商業化的檢測方法的研發提供參考。

1 大腸桿菌O157∶H7的檢測方法及其演變

對于大腸桿菌O157∶H7的檢測技術，從最傳統的發酵法和濾膜法到當下結合各類生物技術的檢測方法離不開研究人員的不斷改進[12]，在此總結了大腸桿菌O157∶H7檢測技術的發展歷程(圖1)。

圖1 大腸桿菌O157∶H7檢測技術發展

傳統的檢測方法所面臨的問題有耗時長、靈敏度低以及特異性、選擇性薄弱等不充分的因素，近年來，在傳統檢測方法的基礎上研究出了更為準確、快速的免疫學檢測技術，包括酶聯免疫分析法、免疫磁珠分離體檢測技術、雙功能抗體檢測技術、膠體金檢測技術等[13]，PCR技術也在大腸桿菌的檢測領域受到青睞和認可，從常規PCR優化逐步地發展到熒光定量PCR、多重PCR、基因重組系列PCR等[14]。但是，目前的主流檢測依舊是傳統的培養分離鑒定的方法。表1對近年來常用方法的原理、優缺點等進行了比較分析。

表1 大腸桿菌O157∶H7常用檢測分法分析

生物傳感器在致病菌檢測技術領域因具有高效、特異、結構小巧、經濟實用等諸多優點取得了長遠的發展。基于免疫識別的生物傳感器可快速檢測大腸桿菌O157∶H7，主要包括兩類檢測方法：一類是免標記生物傳感器直接檢測，另一類是帶標記生物傳感器間接檢測[15]。此外，近年來，核酸適配也被廣泛用于生物傳感器探針分子檢測[16-17]。因優勢突出，生物傳感器在大腸桿菌O157∶H7檢測中發揮著日益重要的作用。

2 生物傳感器在檢測大腸桿菌O157∶H7中的應用進展

近年來，生物傳感器技術依托于自身經濟實用、結構小巧、特異性強及高效便捷等優勢在致病菌菌株檢測方面取得了巨大的進步[24-26]，已經成為一種備受大眾認可的通用分析工具。生物傳感器技術原理在于制備或選擇出可與待測物特異性結合的適配體作為識別原件，然后選擇一類納米粒子作為信號轉導元件相結合，形成適配體生物傳感器[27]。通常習慣以轉換平臺為基礎進行分類，將其分成表面增強拉曼、熒光、比色、光學、電化學、試紙條六大類(圖2)[28]。總體來看，生物傳感器技術在大腸桿菌O157∶H7檢測中的應用經歷了由點至面的過程，從小范圍應用向大范圍應用不斷擴展。隨著生物傳感器技術的不斷更新，其在大腸桿菌O157∶H7檢測方面發揮了日益重要的作用。

圖2 病原體檢測常用傳感器示意圖[28]

2.1 表面增強拉曼散射傳感器

表面增強拉曼散射(surface enhanced Raman scattering, SERS)主要是通過與粗糙金屬表面的相互作用，使信號分子放大分析容性以及SERS檢測所具有的獨特的物理、化學和光學性質，可通過修改結構組成、表面和顆粒大小提高表面增強拉曼散射強度。如利用適體和納米粒子結合表面增強拉曼散射來識別大腸桿菌O157∶H7。最開始運用的傳統連接法有物理吸附，雖然簡單有效但是吸附適體不穩定，容易發生非特異性位移導致假陽性結果[29-30]。另一種方法是共價結合，將帶有硫醇、氨基和其他基團的適體共價連接到納米粒子的表面，不過該方法費用高，而且一旦遇到更具競爭性的試劑結合基團就可能被去除[31-32]。后來，隨著需求的推動和技術的發展，開始嘗試用嵌入連接法改善上述問題，有效彌補了傳統連接法的不足。

在SERS傳感器中，金納米骨增強超靈敏表面增強拉曼散射適配傳感器出現的時間較早。研究表明，將適配體Apt-1和雷達歸航信標嵌入金納米棒(gold nanorods，GNRs)表面，最后形成一種具有識別能力、信號穩定的再生長金納米骨NBs(GNRsApt-1+RhB)(Apt-1和Apt-2序列見表2)[29]。該傳感器是通過假設由適配傳感器和信號分子組成的核酸分子可以被開發成具有可控性的表面形態，而提高信號強度和穩定性。

表2 Apt-1和Apt-2序列和作用

利用開發的金納米骨SERS傳感器來檢測大腸桿菌O157∶H7的主要過程為(圖3)：先在磁性納米粒子上加入適配體Apt-2形成捕獲探針，而后加入需檢測的大腸桿菌O157∶H7，再加入上述所得信號探針，其信號探針內適配體Apt-1的作用是為了保證高穩定性、高識別性以及增強拉曼散射信號強度。在有磁場的情況下，用SERS觀察1 350 cm-1處的表面增強拉曼散射信號強度。1 350 cm-1處的拉曼信號強度和大腸桿菌濃度的對數存在線性關系(y=180.30x-61.49，R2=0.998 2)，大腸桿菌濃度范圍為10～10 000 cfu·mL-1，檢出限(limit of detection，LOD)為3 cfu·mL-1。在完成實際樣品的回收試驗后，用實際飲用水和萵苣樣品評價了開發的適體傳感器的準確性和實際應用情況。其相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)不超過5.2，樣品回收率為96.95%～105.88%，適體傳感器的LOD、信號穩定性、檢測時間和回收率證實了其優良的定量檢測性能[33]。提示開發的適體傳感器SERS平臺在食品安全、環境監測和危害分析應用方面有著廣闊的前景。

圖3 金納米骨適體傳感器檢測大腸桿菌O157∶H7的示意圖[33]

2.2 熒光傳感器

熒光傳感器可以把生物檢測以電化學信號變化來顯示出來，并實現對生物、化學信息的定量分析。以碳納米復合材料為基礎的新型熒光傳感器能夠有效檢測牛奶中大腸桿菌O157∶H7。通過氧化還原反應形成基于羰基鐵粉(carbonyl iron powder，CIP)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNT)的磁韌帶。在酸性溶液中，CIP與H+反應生成正電荷Fe2+，在反相電荷的吸引下，帶負電荷的MWCNT會與CIP顆粒結合，形成磁性納米復合物，吸附在納米粒子表面。由于π疊加作用，6-羧基熒光素(6-carboxy fluorescein group, FAM)標記的適配體會隨機包裹在CIP@MWCNT的側壁上，而FAM分子接近CIP@MWCNT，有效地在大腸桿菌O157∶H7猝滅了染料的熒光，適配體離開CIP@MWCNT的側壁。因為適配體對大腸桿菌O157∶H7的親和力和特異性高于CIP@MWCNT，所以熒光被關閉時，適配體仍然吸附在CIP@MWCNT上[34]。圖4體現了基于CIP@MWCNT的Advanced Packaging Tool(服務器系統)傳感器上大腸桿菌O157∶H7的分析過程[35]。

圖4 基于CIP@MWCNT的檢測大腸桿菌O157∶H7的傳感器示意圖[35]

反應式：

CIP-Fe + H+→ CIP-Fe2+

MWCNT-COOH → MWCNT-COO-+ H+

CIP-Fe2++ MWCNT-COO-→ MWCNT-COOFe-CIP

開發的基于CIP@MWCNT的熒光檢測傳感器可成功地應用于污染樣品基質中大腸桿菌O157∶H7的診斷。在制備的適體傳感器下大腸桿菌O157∶H7的濃度可達到7.15×103cfu·mL-1。此外，根據性能分析，這種新型磁性納米復合材料修飾的適體傳感器具有可靠和穩定的靶向能力[34]。基于CIP@MWCNT的適體傳感器在實際樣品中能快速、靈敏地檢測大腸桿菌O157∶H7，具有廣闊的應用前景。在未來，預計這種開發的適體傳感器將用于監測真實樣品中多種類型的食源性病原體。

2.3 比色傳感器

比色傳感器具備直觀讀出結果、使用方便、操作簡單等優點，在檢測大腸桿菌O157∶H7領域中備受關注[36]。其主要原理是將目標信號轉化為顏色變化的過程，顯色底物和催化酶的選擇是比色法的關鍵。

在Wen等[37]成功組裝了適體傳感器后，比色傳感器檢測大腸桿菌的性能得到了質的提升。大腸桿菌O157∶H7與適體在囊泡界面的分子識別，導致聚二乙炔(polydiacetylene，PDA)的藍-紅轉變，這種轉變肉眼很容易看到，檢測原理見圖5。在研究中，用共聚焦激光掃描顯微鏡和透射電鏡證實了截短適體與大腸桿菌O157∶H7的特異性相互作用。電容器可在2 h內檢測到104～108cfu·mL-1的細胞濃度，大腸桿菌O157∶H7的相應檢出率為98.5%[37]。

圖5 比色傳感器檢測大腸桿菌O157∶H7的原理[37]

2.4 化學發光傳感器

化學發光為物質在進行某些化學反應時伴隨產生的光輻射現象。目前常見的化學發光適配體傳感器(chemiluminescence aptasensor)是在體系中引入相關元件進行發光反應，或是在核酸適配體上標記化學發光因子[38]。此類傳感器具有重復利用率高、靈敏度強等特點，正因如此，檢測大腸桿菌時往往會用到化學發光傳感器。

為了提升化學傳感器在檢測大腸桿菌當中的性能與作用，Khang等[39]實現了技術上的突破，極大的提高了樣品中大腸桿菌O157∶H7的檢測效果，縮短了定量樣品中大腸桿菌O157∶H7所用的時間。大腸桿菌O157∶H7適體結合的FAM具有良好的特異性，當混合物在37 ℃下培養1 h時，能捕獲樣品中的大腸桿菌O157∶H7。根據游離適體與GO/鐵納米復合物π-π堆積相互作用的原理，用GO/鐵納米復合物去除培養后殘留在樣品中的游離大腸桿菌O157∶H7適體。當樣品中加入鳥嘌呤化學發光試劑時，樣品中與適體FAM結合的大腸桿菌O157∶H7會發出強光。隨著大腸桿菌O157∶H7濃度的增加，鳥嘌呤化學發光反應的發光強度成比例增加。總體來看，此大腸桿菌O157∶H7生物傳感器的LOD低至4.5 cfu·mL-1，具有良好的準確度、精密度和重現性，有望在食品安全和公共衛生領域得到應用。

2.5 電化學傳感器

電化學適體傳感器制備時，會將電化學活性信號傳導元件和核酸適配體結合固定在電極表面，所測試靶標存在時，會與核酸適配體特異性結合，導致電極表面變化，通過檢測變化的電化學信號實現對大腸桿菌的定性或定量檢測。

在電化學適體傳感器方面，Wang等[40]開發出了一種基于磁性納米粒子同軸毛細管、脲酶催化和多氯聯苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)電極的電化學傳感器，用于快速、靈敏地檢測大腸桿菌O157∶H7。利用免疫磁性納米粒子(magnetic nanoparticles, MNPs)的同軸毛細管實現目標細菌的特異性分離，脲酶與尿素放大阻抗信號，PCB金電極測量阻抗變化。將鏈霉親和素修飾的MNPs與生物素化的多克隆抗體(polyclonal antibodies，PAbs)偶聯形成免疫MNPs，并用高梯度磁場將其捕獲在同軸毛細管中，將細菌從大量樣品中分離出來。然后，用抗大腸桿菌和脲酶的適體修飾GNPs，將其注入毛細管與細菌反應，形成MNP-PAb-細菌適體-GNP-脲酶復合物[34]。最后，利用化合物上的脲酶催化尿素水解為毛細管中的銨離子和碳酸鹽離子，導致過氧化氫的阻抗降低，用鍍金PCB電極測量。過氧化氫的阻抗變化與細菌的濃度呈良好的線性關系。該傳感器能在3 h內檢測低至10 cfu·mL-1的大腸桿菌，在牛奶中大腸桿菌的平均回收率為99%。由此可見，該傳感器具有檢測時間短、靈敏度高、成本低等優點，有不錯的應用前景。

圖6 發光傳感器檢測大腸桿菌O157∶H7的原理[39]

圖7 電化學傳感器快速檢測大腸桿菌的原理[40]

2.6 側流傳感器

側向流生物傳感器是將側向流動型試紙與核酸適配體相結合的技術，靶標菌與適配體結合形成復合物后進行擴增，擴增產物加入側向流試紙后會進行可視化信號輸出[23]。該技術整合了Linux From Scratch和適配體在分子檢測領域的優勢，方便攜帶、操作簡單，也可直觀的快速檢測，但無法進行準確的定量分析[28]。在橫向血流免疫分析法(lateral flow immunoassay，LFIA)中使用的常用測試條由樣品、共軛墊和吸收墊以及膜組成。金納米粒子(AuNPs；標記劑)和抗體(識別元件)是試紙法中最重要的成分，如圖8所示。三明治格式是LFIA中使用最多的系統，在夾心LFIA中，一種抗體固定在膜上，另一種識別不同表位的抗體用AuNPs標記。在2種抗體之間捕獲分析物[41]。去年Wang等[42]報道了一種基于納米酶細菌抗體的快速檢測多讀出和無標簽的LFIA。這種無標簽的LFIA可以在西瓜汁、牛奶和卷心菜沙拉中的102 cfu·mL-1的低檢測極限下表現出優異的檢測性能，檢測范圍為102～108 cfu·mL-1。

圖8 側流適體傳感器檢測大腸桿菌的原理[41]

3 展望

隨著衛生事業、醫學事業、科學事業的發展以及人民生活水平的提升，食源性致病菌污染問題備受重視。要想切實保障人民的健康，就必須對大腸桿菌O157∶H7進行及時檢測和有效預防。兼具接受器與轉換器雙重功能的生物傳感器對于監測大腸桿菌O157∶H7有重要意義。

大腸桿菌O157∶H7的檢測方法隨著時間的推移在不斷完善，監測朝著科技化、精準化、快速化的方向逐漸演變；生物傳感器在大腸桿菌檢測中的應用經歷了范圍由小至大、深度由淺入深、效果由一般到逐漸理想化的轉變。簡而言之，生物傳感器技術在檢測大腸桿菌當中的應用經歷了由點至面的過程，從小范圍應用向大范圍應用不斷擴展，在生物傳感器技術不斷發展的過程中，其在檢測大腸桿菌方面發揮了日益重要的作用。

就目前來看，生物傳感器在大腸桿菌檢測中的應用會繼續朝著科技化方向發展，或許生物傳感器會同當下流行的人工智能技術、信息技術良好結合，從而提高檢測的精準度、加快檢測的速度、進一步提高升檢測的準確度。進而開發的方法可以應用于檢測其他食源性病原體，如沙門氏菌、李氏菌和弧菌等。期望將來能夠開發一種先進的生物傳感器，能夠同時監測存在于樣本中的多種食源性病原體。