脛骨橫向骨搬移術后皮膚干細胞促進重度糖尿病足創面再生愈合的機制研究

姜圣潔，花奇凱，陳炎，李山郎，劉光煒，聶新宇，蘇宏杰，鄺曉聰，3*

(1.廣西醫科大學基礎醫學院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫科大學再生醫學研究中心，廣西 南寧 530021；4.廣西生物醫藥協同創新中心，廣西 南寧 530021)

糖尿病容易引發神經與血管慢性損傷，在下肢，尤其是足部皮膚多導致難愈性潰瘍，被稱為糖尿病足。在糖尿病患者的整個病程中，約有1/4概率罹患糖尿病足，全球每年約400萬患者發病，而其中的重度糖尿病足是糖尿病患者截肢的主要原因[1-2]，分析發現，約85%以上糖尿病患者由于重度糖尿病足而截肢。糖尿病足治療最佳結果是保肢，但仍然是當前治療的一大難題。目前常規清創、換藥方法以及植皮、皮瓣移植等治療手段，未能達到預期的愈合效果[4-5]，尤其對于Wagner 3、4級重度糖尿病足患者，截肢率則更高。

針對高截肢率的重度糖尿病足，近幾年花奇凱團隊采用脛骨橫向骨搬移術治療可顯著提高重度糖尿病足患者潰瘍創面的愈合率，縮短愈合時間，其依托原理是張力-應力法則理論[6]。張力-應力法則僅僅是臨床現在的生物學規律的邏輯總結，并未涉及其中具體的分子與細胞機制。本次研究從創面局部皮膚干細胞活化角度，初步研究脛骨橫向骨搬移術促進重度糖尿病足難愈性創面再生愈合的分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年6月至2018年1月在廣西醫科大學第一附屬醫院骨關節外科住院，經脛骨橫向骨搬移治療的126例重度糖尿病足患者為研究對象，其中男94例，女32例，年齡39～86歲，中位數年齡61歲；Wagner分級構成：3級67例，4級57例，5級2例；TEXAS分級構成：2B級50例，2C級6例，2D級9例，3B級17例，3C級1例，3D級43例。脛骨橫向骨搬移術治療經廣西醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會審查通過。

納入標準：(1)Wagner 3級及以上糖尿病足患者；(2)患者具有強烈的保肢意愿；(3)簽署知情同意書。排除標準：(1)患者的基礎條件差，不能耐受手術；(2)動脈完全閉塞，且無明顯側枝循環形成者；(3)患者有嚴重的心肺疾患、肝腎功能不全；(4)免疫功能差或長期接受類固醇治療。

1.2 實驗材料與方法

1.2.1 主要試劑 小鼠抗人CK19單克隆抗體(Abcam)、兔抗人LGR5多克隆抗體(Abcam)、酶標山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G(immunoglobin G，IgG)工作液(北京中杉金橋生物技術公司)、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)。

1.2.2 創面愈合情況及大體觀察 記錄創面愈合時間，肉眼觀察創面經脛骨橫向骨搬移治療后的愈合過程。

1.2.3 標本收集 術前及術后1個月復診時切取創面邊緣組織，用10%福爾馬林固定、石蠟包埋，切片備用。

1.2.4 創面組織病理學觀察 將切片常規脫蠟水化后，進行蘇木素-伊紅染色，光學顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.2.5 創面組織中CK19、LGR5陽性細胞分布與蛋白表達情況觀察 采用免疫組織化學染色法，創面組織蠟塊常規脫蠟、水化、修復，依次滴加一抗稀釋液小鼠抗人CK19單克隆抗體(1︰1 000)、兔抗人LGR5多克隆抗體(1︰25)，和采用酶標山羊抗小鼠/兔IgG二抗以及DAB顯色，封片后光鏡下采圖，以Image J軟件進行LGR5、CK19染色陽性細胞面積比例測算。

2 結 果

2.1 創面愈合情況及創面大體觀 納入研究的126例患者，1例截肢，125例患者創面愈合，愈合時間為(143.5±86.4)d。脛骨橫向搬移術后，傷口早期可見黃色纖維素樣膜性物質，創緣收縮，類似于創面愈合炎癥期；隨后創面邊緣開始增生，向創面中心部位移行，期間鮮紅肉芽組織形成并填充創面，創面邊緣不斷上皮化使創面愈合，僅有少量線性或細條狀瘢痕，見圖1。

2.2 創面組織病理學變化 治療前創面組織表皮層變薄，以基底層明顯，真皮層有大量炎性細胞浸潤且微血管少；脛骨橫向搬移術后，爬行覆蓋創面皮膚組織可見完整表皮結構，基底層細胞增多，真皮層炎性細胞減少，可見豐富的微血管、膠原纖維和腺管結構，見圖2。

a 術前表皮層、真皮層 b 術前皮下組織 c 術后表皮層和真皮層 d 術后皮下組織

2.3 創面組織中CK19、LGR5表達情況 潰瘍創面邊緣組織中，CK19蛋白是細胞質染色陽性，在術后創面組織，陽性細胞聚集性分布于表皮、真皮以及皮下腺體組織中，但基底層細胞未見明顯的CK19陽性細胞，其CK19陽性細胞面積比為(9.095±2.926)%，顯著高于術前的(1.834±0.772)%，兩者比較t=13.141，P<0.05。LGR5蛋白是細胞質染色陽性，主要分布于皮膚真皮層的腺管樣結構的上皮細胞中，術前創面組織中LGR5細胞面積比為(1.398±0.620)%，治療后LGR5為(6.781±1.889)%，兩者比較t=14.829，P<0.05(見圖3～4)。

3 討 論

脛骨橫向骨搬移術衍生于外固定架技術，但已經拓展了外固定架技術的應用范疇，現在多用于各種下肢難愈性創面的治療，療效顯著，如糖尿病足、骨髓炎潰瘍等[6-8]。從其遵循基本的張力-應力法則來看，其認為在活體組織受到持續穩定的緩慢牽伸張力時，可以刺激組織發生類似胎兒組織的細胞分裂，參與組織的修復與再生，是一個臨床現象與愈合規律的描述性總結，未涉及其中的細胞與分子機制。本次研究納入的重度糖尿病足患者，都是經過多家醫院和進行過多次清創、皮瓣移植等治療，療效不佳而成為典型難愈性創面。在脛骨橫向搬移術后，約2～3周開始出現新鮮肉芽，后續又可觀察到創面邊緣上皮開始向創面中心移行，最后愈合創面可見線性或細條狀瘢痕，一般愈合時間為4～5個月，創面已基本愈合為大體觀基本正常的上皮組織。在脛骨橫向搬移術后1個月左右創面邊緣移行的上皮組織取材，發現表皮層結構完整，基底層、棘層、顆粒層、透明層、角質層，真皮層可見以單核細胞為主的炎細胞浸潤，但較術前減少；同時，在此階段已經發現真皮層豐富的微血管、毛細血管、膠原和柱狀上皮構成的腺管樣結構，這均提示移行的上皮組織具有較為完整的組織結構，為后期形成皮膚重塑并形成相關功能提供了細胞與組織結構基礎，這均表明脛骨橫向骨搬移術可促進重度糖尿病足難愈性潰瘍創面的再生愈合，值得進一步研究其中的調控機制。

表2 糖尿病足治療前后創面組織中CK19、LGR5染色陽性細胞面積百分比(%)

a 術前表皮層、真皮層 b 術前皮下組織 c 術后表皮層和真皮層 d 術后皮下組織

a 術前表皮層、真皮層 b 術前皮下組織 c 術后表皮層和真皮層 d 術后皮下組織

本課題組在前期研究也發現，脛骨橫向骨搬移術后創面巨噬細胞極化狀態有所改變，從趨向M1極化的促炎狀態回落至M1/M2均衡狀態，M1和M2細胞數量均減少，但維持一定數量，這和本次發現真皮層中單核細胞為主的炎性細胞浸潤減少是一致的[9-10]。在皮膚再生修復中，一定程度的炎性反應是必要條件，尤其M2巨噬細胞，也稱為“傷口愈合”巨噬細胞，既可以誘導血管生成和組織重塑，還可以分泌抗炎因子，調控創面愈合微環境，通過激活皮膚干細胞來啟動和參與潰瘍創面再生修復[11-12]。本次研究發現CK19和LGR5陽性細胞活化明顯高于術前，提示皮膚干細胞已經被動員與活化參與創面再生修復。其中CK19與表皮干細胞有關，在研究中發現CK19陽性細胞分布在表皮和真皮層，且分布面積明顯增加，基底數量細胞也增加，表明皮膚干細胞參與修復可能是全方位的。尤其值得關注的是，在真皮層腺腔結構中的柱狀上皮細胞有大量LGR5陽性細胞，而LGR5是毛囊干細胞的標志，其分布面積明顯高于術前組織。在后續新生皮膚結構重塑中，CK19和LGR5等陽性的皮膚干細胞均可參與微血管、毛發、汗腺、皮脂腺等組織結構的再生，如LGR5陽性細胞毛發再生的前體細胞[13-14]。而本次研究與前期研究也發現搬移后真皮層出現豐富的微血管。因此，脛骨橫向骨搬移技術能顯著促進重度糖尿病足難愈性創面愈合，其機制可能是通過改善創面愈合微環境，如M1和M2巨噬細胞的調控平衡，在適度的炎性環境中活化皮膚干細胞，如CK19和LGR5陽性細胞，以形成表皮、微血管和皮膚腺體等，達到再生的效果。