種眼影微生物檢驗方法挑戰性試驗研究

＊牟建平 滕寶霞 賀曉文 朱玲 肖靜 曾小梅

（甘肅省藥品檢驗研究院 甘肅 730070）

《化妝品安全技術規范》2015年版中對微生物檢驗進行方法和限值規定[1]，眼影由于含有著色顏料、珠光顏料、酯類基質和抑菌劑等[2]，影響微生物的檢出，本文對4種眼影分別加入陽性指示菌[3]，進行微生物檢驗方法挑戰性試驗，通過計數方法回收率、控制菌生長試驗，建立4種眼影（NOVO鍵盤指尖酷潮眼影星辰11#、希貝單色鉆石眼影41#、希貝單色鉆石眼影14#和希貝單色鉆石眼影18#）的微生物檢驗方法，為其他類別的眼影微生物檢驗提供參考。

1.試驗材料

(1)樣品

NOVO鍵盤指尖酷潮眼影星辰11#，批號：AL528001，規格1.8g；希貝單色鉆石眼影41#淺粉色，批號：XB17111685，規格1.8g；希貝單色鉆石眼影14#寶藍色，批號：XB18051 685，規格1.8g；希貝單色鉆石眼影18#綠色，批號：XB18 051685，規格1.8g。

(2)培養基

卵磷脂吐溫80營養瓊脂，批號：190221；SCDLP液體培養基，批號：180202；孟加拉紅瓊脂，批號：180119；雙倍乳糖膽鹽培養基（含中和劑），批號：180609；Baird-Parker培養基基礎，批號：190122；甘露醇發酵培養基，批號：180811；伊紅美藍瓊脂（EMB），批號：190827；十六烷三甲基溴化銨瓊脂，批號：190813；pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液，批號：20200312，均購于北京陸橋技術股份有限公司。

(3)菌種

大腸埃希菌（ATCC 8739）、銅綠假單胞菌（ATCC 278 53）、枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、白色念珠菌（ATCC 10231）和黑曲霉（ATCC 16404）購于中國食品藥品檢驗研究院。

(4)儀器設備

生物安全柜（ESCD、CLASS11BSC）、生化培養箱（上海一恒、BPMJ-250F）、壓力消毒器（松下、MSL-3781L-PC）、恒溫水浴鍋（杭州米歐儀器有限公司、WT100-2）、顯微鏡（奧林巴斯、BX53+DP74）。

2.方法與結果

(1)菌種

試驗所用菌種為第3代，菌懸液為第4代。

(2)供試液制備

稱取眼影5g加到滅菌的三角瓶中，加入5ml滅菌吐溫-80，加入pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液至100ml，置于45℃水浴中，用勻漿儀混勻2分鐘，制成1:20供試液。

(3)計數方法驗證

加入5種陽性指示菌，采用1:20供試液1ml注皿、1:100供試液1ml注皿，計算回收率試驗，進行微生物計數檢查方法的篩選。指示菌回收率結果見表1。

表1 計數方法適用性試驗回收率

結果采用1:20供試液1ml注皿，NOVO鍵盤指尖酷潮眼影星辰11#供試品銅綠假單胞菌回收率試驗低于50%，對銅綠假單胞菌有抑制作用，希貝單色鉆石眼影41#供試液對銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌回收率低于50%，有抑制作用，采用1:100供試液1ml注皿，回收率大于50%，方法可行；希貝單色鉆石眼影14#和18#采用1:20供試液1ml注皿，5種陽性指示菌回收率均大于50%，方法可行。

(4)控制菌方法適用性試驗

①耐熱大腸菌群耐熱大腸菌群系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在44.5℃培養24～48h能發酵乳糖產酸并產氣，采用《化妝品安全技術規范》2015年版耐熱大腸菌群常規方法進行實驗[1]，可以檢出試驗菌大腸埃希菌，方法可行。結果見圖1，表2。

圖1 耐熱大腸菌群挑戰性試驗

表2 控制菌（耐熱大腸菌群）方法適用性試驗

②金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽孢，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性，采用 《化妝品安全技術規范》2015年版金黃色葡萄球菌常規方法進行實驗[1]，可以檢出試驗菌金黃色葡萄球菌，方法可行。結果見表3。

表3 控制菌（金黃色葡萄球菌）方法適用性試驗

③銅綠假單胞菌屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42℃條件下能生長，采用《化妝品安全技術規范》2015年版銅綠假單胞菌常規方法進行實驗[1]，可以檢出試驗菌銅綠假單胞菌，方法可行。結果見表4。

表4 控制菌（銅綠假單胞菌）方法適用性試驗

3.結論

（1）NOVO鍵盤指尖酷潮眼影星辰11#和希貝單色鉆石眼影41#樣品微生物檢驗方法，計數方法中菌落總數采用1:100供試液1ml注皿，霉菌和酵母菌總數采用1:20供試液1ml注皿，控制菌采用常規方法檢驗。

（2）希貝單色鉆石眼影14#和希貝單色鉆石眼影18#樣品微生物檢驗方法，計數方法菌落總數、霉菌和酵母菌總數均采用1:20供試液1ml注皿，控制菌采用常規方法檢驗。