一例半番鴨感染鴨瘟的病原分離鑒定及病理組織學觀察

張 瑞，劉榮昌，陳長福，黃 瑜 ，程龍飛，傅光華，施少華，陳紅梅，萬春和，傅秋玲

（1. 福建農林大學動物科學學院（蜂學學院），福建 福州 350002；2. 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所/福建省禽病防治重點實驗室，福建 福州 350013；3. 福建省龍巖市動物疫病預防控制中心 福建 龍巖 364000）

0 引言

【研究意義】鴨瘟（Duck plague，DP），又稱鴨病毒性腸炎（Duck virus enteritis，DVE），是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種烈性傳染病，其病原為鴨瘟病毒（Duck plague virus，DPV）[1]。DPV屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科馬立克病毒屬鴨甲皰疹病毒1型成員，基因組為雙股線狀DNA，大小約160 kb。DPV基因組結構為UL-IRS-US-TRS，主要分為長獨特區（UL）、兩端的內部重復序列（IRS）、短獨特區（US）和末端重復序列（TRS），共包含約78個開放閱讀框（ORFs）[2]。DPV感染會引起鴨實質器官局灶性壞死并增加血管通透性，從而導致組織器官、淋巴和消化道大量出血[3]。臨床上，患病鴨主要表現為體溫升高、食欲減退、下痢、眼瞼水腫、流淚等癥狀，發病率和病死率可高達100%[4]。目前，鴨瘟仍是危害養鴨業的嚴重傳染病之一?！厩叭搜芯窟M展】1923年，Baudet等首次在荷蘭的患病鴨群中發現鴨瘟病毒，隨后全球多個國家和地區陸續報道了此病的發生[1]。國內，黃引賢等于1957年在廣州首次報道了鴨瘟病例[5]。隨著鴨瘟疫苗的研制與應用，該病曾得到了有效控制。姜甜甜等[6]報道了2個免疫過鴨瘟病毒疫苗的種鴨群發病，研究發現感染該場的鴨瘟病毒主要囊膜蛋白并未發生變異。2015年，福州的2個鴨場突發疫病，病死率高達93%，劉榮昌等[7]對此展開調查研究，確定其為DPV感染所致。傅光華等[8]從2016—2017年福建省部分地區鴨瘟疑似病例中分離到24株鴨瘟病毒，經過序列測定分析發現與我國DPV參考強毒株相比已出現不同程度的變異。【本研究切入點】2020年8月，福建省福州地區某半番鴨養殖場發生疫情。該場共飼養半番鴨2 000羽，于200日齡左右開始發病，發病1W后其總發病率約為65%，病死率高達90%以上。感染后耐過鴨皮膚表面可見大量出血，嚴重影響肉鴨的屠宰和上市。該場發病期間使用多種藥物治療無效，遂送于本研究室就診?！緮M解決的關鍵問題】為明確其病因，分別采集病發病鴨心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎臟、皮膚等組織進行鴨常見病原檢測、病毒分離鑒定、基因序列測定分析及病理組織學觀察，以期為該病的診斷及防控提供科 學依據。

1 材料方法

1.1 主要試劑

9日齡番鴨胚購自莆田溫氏家禽有限公司；EasyPure?Viral DNA/RNA Kit、EasyS-cript?One-Step RT-PCR SuperMix和2×Easy Taq PCR Super Mix購自Transgen公司；DNA分子量標準DL2000購自TaKaRa公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）購自Dfico公司；Todd Hewitt Broth購自OXOID公司；高速離心機為Gene公司產品；PCR儀、電泳儀和凝膠 成像系統Versa Doc 2000為Bio-Rad公司產品。

1.2 引物設計與合成

參照文獻[9]，合成常見鴨病毒性疾病（禽流感病毒、新城疫病毒、鴨瘟病毒、禽坦布蘇病毒、鴨甲肝病毒、禽坦布蘇病毒、水禽細小病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨3型腺病毒、禽4型腺病毒、鴨星狀病毒、鴨圓環病毒）檢測引物。參照文獻[10]，合成UL2基因引物UL2F/UL2R，用于擴增鴨瘟病毒的UL2基因。以上引物均由福州鉑尚生物技術（上海）有 限公司合成。

1.3 病料處理

無菌采集病死鴨心臟、肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊和皮膚等組織，一部分用于鴨常見病毒（RT-）PCR檢測和病原分離，另一部分用于細菌分離鑒定。同時采集發病鴨心、肝、脾、肺、腎、皮膚等組 織，固定于10%福爾馬林，用于病理組織學觀察。

1.4 細菌分離

無菌采集發病鴨的腦及肝臟組織，將肝臟和腦組織劃線無菌接種于不同培養基平板（麥康凱瓊脂平板、鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板）上，37 ℃恒溫 培養24～48 h，觀察細菌生長情況。

1.5 （RT）PCR檢測

按北京全式金生物技術有限公司Easy Pure Viral DNA/RNA Kit試劑盒操作，提取病毒核酸。參照文獻 [9]，進行鴨常見病毒（RT-）PCR檢測。

1.6 病毒分離與鑒定

將采集的內臟和皮膚組織分別剪碎、勻漿，加入PBS制成1∶5組織懸液，反復凍融3次，6 000 r·min?1離心10 min，加雙抗作用30 min后，用220 nm濾器過濾。濾液各以200 μL·枚?1經尿囊腔接種9日齡番鴨胚5枚37 ℃恒溫孵化，連續觀察7 d，無菌收集死亡胚尿囊液，盲傳3代，收集尿囊液，對收集的尿囊液進行鴨常見病毒（RT-）PCR檢測。樣品于?80 ℃儲 存備用。

1.7 序列測定與分析

使用引物UL2F/UL2R擴增新分離鴨瘟病毒的UL2基因，按照EasyPure Viral DNA/RNA提取試劑盒說明，提取樣品中病毒核酸。獲得的DNA樣品用Easy Script One-Step PCR SuperMix試劑盒按說明書進行PCR擴增，PCR反應按50 μL體系進行擴增：2×Easy Taq PCR Super Mix 25 μL，ddH2O 17.5 μL，上下游引物各1.25 μL，DNA模板5 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸10 min，35個循環。擴增產物送福州 鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序。

1.8 組織病理學觀察

對上述（1.3）固定的組織依次按照修塊、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（4 μm）的步驟制備病理切片，經HE染色后于光學顯微鏡下觀察病理組 織學變化，拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 剖檢病變

送檢病鴨可見頭頸腫脹（圖1-A），皮膚表面有大量散在的點狀或塊狀出血（圖1-B），肝臟腫脹，外觀呈不均勻斑駁狀，表面有不規則的出血點或出血斑（圖1-C）。

圖 1 發病鴨鴨剖檢病變圖Fig. 1 Necropsy lesions in diseased ducks.

2.2 實驗室檢測

2.2.1 細菌分離結果 無菌挑取病死鴨腦及肝臟組織接種于不同培養基平板，37 ℃培養48 h后，所接種 平板均未見菌落生長，因此可排除細菌感染。

2.2.2 （RT）PCR檢測 ? 對臨床樣品進行鴨瘟、禽流感、新城疫、鴨肝炎、禽坦布蘇病毒、水禽細小病毒、鴨3型腺病毒、禽4型腺病毒、呼腸孤病毒、鴨星狀病毒和鴨圓環病毒等鴨常見病原檢測，結果在實質臟器及皮膚組織中均檢測出鴨瘟病毒，其余病原檢測均為陰性（圖2）；由此，可初步判斷該 病例為DPV感染所致。

2.3 病毒分離與鑒定

將病鴨內臟和皮膚組織勻漿液分別接種9日齡番鴨胚，48～144 h可陸續觀察到胚體死亡，死亡胚體出現水腫和出血。收集接種后死亡鴨胚尿囊液，對收集尿囊液和胚體按1.5方法進行（RT-）PCR檢測，結果均為DPV陽性（圖3），表明新分離病毒為 鴨瘟病毒，將該株病毒命名為FJ2020176。

2.4 UL2基因序列測定與分析

以新分離鴨瘟病毒核酸為模板，進行UL2基因擴增，結果獲得包含UL2全基因的1 311 bp片段，與預期相符（圖4）。

對新分離鴨瘟病毒UL2基因序列進行測定，去除前后多余的核苷酸序列，獲得全長為1 002 bp的UL2基因完整序列，將測得序列上傳至NCBI數據庫，獲得GenBank登錄號為MW032438。序列比對分析顯示，新分離株FJ2020176 UL2基因與DPV強毒株CHv株、CV株和2085株核苷酸相似性高達97.8%～99.9%（圖5）。與疫苗株VAC株、Attenuated strain 1株和Attenuated strain 2株相比，新分離鴨瘟病毒FJ2020176株在UL2基因中存在528 bp的核苷酸 插入，表明FJ2020176株為鴨瘟病毒強毒株。

圖 2 臨床采集樣品的PCR檢測Fig. 2 PCR detection on clinical samples

圖 3 臨床采集樣品的PCR檢測Fig. 3 PCR detection on clinical samples

圖 4 分離病毒的PCR擴增結果Fig. 4 PCR amplification result on isolated virus

2.5 組織病理學觀察

組織病理學觀察可見肝臟發生局灶性壞死，肝臟出血、肝細胞壞死（圖6-A、B）；脾臟組織白髓減少，淋巴細胞壞死、脫落（圖6-C、D）；腎臟出血、淤血，腎小管上皮細胞變性、壞死（圖6-E、F）；法氏囊出血，淋巴小結壞死（圖6-G、H）；皮下出血（圖6-I、J）。

圖 5 鴨瘟病毒UL2基因同源性分析Fig. 5 Homology on UL 2 gene of duck plague virus

圖 6 感染鴨組織病理切片Fig. 6 Pathological slices of infected duck tissues

3 討論與結論

我國的鴨瘟病毒抗原性高度保守，相關疫苗的使用對該病可起到顯著的預防效果[1]。但近年來，我國養鴨場中常出現已免疫鴨群發病的情況[6,11]，加之缺少典型病變鴨瘟病例的出現[7]，使得鴨瘟的診斷和防控形勢變得愈加復雜。因此，在臨床上，除了觀察患病鴨的特征性病變外，還應結合實驗室診斷，以免出現誤診。

DPV侵染機體可引起實質器官漸進性的退行性變化，以及由于血管損傷而引起的組織出血和體腔溢血[12]，本病例臨床剖檢可見肝臟的輕微腫大、出血。較為特別的是，臨床癥狀除了頭頸腫脹這一鴨瘟典型癥狀外，還表現為皮膚的大面積出血，此癥狀在以往的報道中未曾出現。同時，從皮膚中成功分離出鴨瘟病毒，表明此株鴨瘟病毒入侵的靶器官可能還包括皮膚組織，病毒的組織嗜性是否有所改變，還需進一步研究。對FJ2020176株的UL2基因進行分析發現，其與強毒株CHv株、CV株和2085株有極高的同源性；與弱毒株相比，在UL2基因中間有528 bp的插入，符合鴨瘟強毒株特征[13]，表明新分離的DPV為鴨瘟病毒強毒株。

組織病理學觀察顯示，DPV對感染鴨內部組織器官有不同程度的損傷，其中以肝臟、脾臟、腎臟等實質臟器出血、淤血最為明顯。脾臟和法氏囊是禽類重要的免疫器官，這些免疫器官在識別和清除體內的抗原性異物和自身變性細胞中具有重要作用[14]。本病例的脾臟和法氏囊也有一定程度的病變，病理組織學觀察可見感染鴨脾臟紅髓和白髓結構不清，白髓內淋巴細胞減少；法氏囊淋巴細胞出現缺失和壞死，預示著患鴨免疫功能可能下降，機體易受到其他病原體的侵害。肝臟和腎臟也有相似的病變，表現為肝、腎的出血、瘀血和相關組織細胞的壞死，由此可見，患鴨的免疫系統、消化系統和泌尿系統均已遭到病毒損壞。外部組織的病變則以皮下大面積出血為特征，組織病理學觀察可見皮下有大量出血、淤血，與臨床剖檢結果一致。此次送診的病例，除皮膚的病理變化外，其余各臟器病理變化均與已報道的鴨瘟病變基本相符[15,16]。

未免疫鴨瘟疫苗是該場鴨群發病的主要原因，因此在生產過程中，應提高免疫意識，制定合理的免疫程序，選擇合適疫苗及時免疫，切不可掉以輕心，以免造成損失。本研究對一起皮膚大量出血的發病鴨群進行病原分離鑒定及病理組織學觀察，并從該發病鴨皮膚組織中分離到一株鴨瘟病毒強毒株，表明皮膚出血亦為鴨瘟病例的臨床特征。以上結果為臨床上鴨瘟的診斷提供了新的試驗數據。