簇生稻穗發育及細胞周期相關基因的表達分析

陳麗萍，蔣家煥，鄭燕梅，朱永生，王穎姮，林 強，謝鴻光，羅 曦，蔡秋華，謝華安 ，張建福

（1. 福建省農業科學院水稻研究所，福建 福州 350018；2. 農業農村部華南雜交水稻種質創新與分子育種重點實驗室/福州（國家）水稻改良分中心/福建省作物分子育種工程實驗室/福建省水稻分子育種重點實驗室/福建省作物種質創新與分子育種省部共建國家重點實驗室培育基地/雜交水稻國家重點實驗室華南研究基地，福建 福州 350003；3. 水稻國家工程實驗室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】水稻是全世界重要糧食作物之一，也是我國最主要的糧食作物。穗是水稻產量形成的關鍵部位，穗型是影響水稻產量的一個重要因素，穗粒數的增加可以直接提高水稻的產量，目前通過常規途徑來增加穗粒數和穗密度實現增產已有較大難度。簇生穗（Clustered Spikelets）是水稻穗部形成2～3粒籽粒簇生的一種異常現象，是水稻穗部的一種突變，有雜交變異和理化誘變等多種來源途徑，將簇生稻（也稱為復粒稻、麥粒稻）的簇生性狀轉育到正常單粒稻中，能有效縮短穗長并增加其穗粒數和著穗密度，對創造簇生稻新材料及提高產量等都具有重要意義[1?2]。【前人研究進展】簇生穗通常表現為枝梗頂端同時著生2～3粒穎花，大多數為3粒，形狀呈“W”形排列[3]。美國科學家Jodon在1957年發現首個水稻主穗軸和一次枝梗頂端都著生2～3朵穎花的簇生穗突變體，此后又有多位學者對不同的水稻簇生穗材料進行了遺傳學分析，發現水稻簇生穗突變體主要歸結于兩類，一類是多數枝梗中下部位簇生2個或2個以上小穗，稱為枝梗小穗簇生突變體，定位于4號染色體上；另一類為枝梗頂端著生2～3粒籽粒的簇生穗突變體，定位于6號染色體上[4?8]。Jiang等[9]首次從一個9311簇生穗突變體中成功克隆了位于6號染色體上的簇生穗調控基因sped1-D，其編碼一個三角狀五肽重復蛋白，可能通過阻斷RFL、Lax、WOX3等穗發育相關基因來縮短小花花梗和次級枝梗長度，并影響水稻小花花粉育性。同年，Guo等[10]也在9311遺傳背景下克隆了位于4號染色體上的簇生穗調控基因CL4，其編碼一個假定的細胞色素P450蛋白CYP724B1，該蛋白參與油菜素內酯的生物合成。Sped1-D和CL-4得以成功克隆與研究，使得我們對簇生穗基因的生物學功能有了初步的了解，但其具體的分子機理仍有待進一步闡明。植物中常常存在一個基因可影響許多性狀的發育而引起多方面表型效應的現象，并且單個性狀的發育也通常是由多個基因控制的一系列生化過程連續作用的結果。前人研究表明，水稻中常常存在多個基因共同對穗發育的某個節點起調控作用最終導致穗發育的異常：如OsMFT1通過抑制FZP和5個SEPALLATA-like基因的表達致使分枝分生組織向小穗分生組織的轉變被延遲，從而產生更多的穗分枝[11]；Gnp4通過與LAX相互作用一起參與調控水稻分生組織，從而控制水稻二次枝梗側穎花形成及籽粒長度[12]。GL3.1通過影響細胞周期蛋白CycT1;3的磷酸化來控制水稻籽粒大小和產量[13]。細胞的發育需要通過精確、保守的機制對細胞周期進行適當的執行和調控。真核生物細胞周期進程調控的分子機制是高度保守的,細胞周期調節因子包括細胞周期蛋白（cyclins）、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑（CDK inhibitors，CKIs）、成視網膜瘤蛋白（Retinoblastomas，Rbs）同系物和E2F轉錄因子等在細胞周期控制、轉錄調控、DNA損失修復等有關腫瘤形成的過程中有重要作用[14]。動物中細胞周期調節因子失調常常導致細胞增殖異常，形成腫瘤。植物中細胞周期相關基因發生變異也常常導致其小穗、花器官發育異常。多花小穗突變體mfs1小穗分生組織轉變到花分生組織延遲，出現一個額外的類穎殼器官和一個伸長的小穗軸，且護穎和內稃退化[15]。KRP1在水稻種子形成過程中從細胞有絲分裂周期脫離時發揮重要作用，其過表達植株種子灌漿明顯降低[16]。細胞周期蛋白OsSDS的過表達突變體在營養生長階段與野生型沒有顯著差異，但在生殖生長階段卻表現出雌雄配子均無活性、小穗完全不育[17]。【本研究切入點】相比于水稻正常穗在枝梗上的單粒著生，簇生穗是穗部的一種突變，屬于發育缺陷，目前2個已克隆的簇生穗基因都是獨立進行研究的，具體的調控機理仍不夠清楚。在前期工作中，我們以簇生穗品種內江P164和單粒稻品種9311為親本構建定位群體，最終將簇生穗基因精細定位到6號染色體上，定位區間內包含已克隆的簇生穗基因sped1-D的等位基因但變異位點不同，命名為OsCl-6[18]，簇生穗突變體主要表現為二次枝梗的數目及長度異常，目前已有不少基因被報道與二次枝梗發育及二次枝梗向花器官轉變相關，但這些基因與簇生穗調控基因是否有直接關聯也尚未見深入的研究。【擬解決的關鍵問題】本研究旨在通過qRT-PCR技術對簇生穗材料內江P164與單粒稻材料9311中枝梗發育相關基因及細胞周期相關基因的表達進行分析，探索簇生稻中穗發育相關基因及細胞周期相關基因在表達量上的關聯，進一步深入對簇生穗基因的了解，為高產水稻品種選育提 供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

內江P164（Oryza sativa. Ssp. indica）為來自四川省農業科學院的一個簇生穗自然突變體。9311（Oryza sativa. Ssp. indica）為江蘇里下河地區農業科學研究所選育的單粒稻秈稻品種。分別在2019年正季種植于福建福州水稻所網室大田及2019年晚季種植于南靖基地大田。

1.2 水稻RNA提取及反轉錄

水稻幼穗RNA提取采用天漠公司的ZR Plant RNA MiniPrep試劑盒。

1.3 qRT-PCR分析

qRT-PCR使用Vazyme的SYBR qPCR Master Mix，20 μL反應體系，反應混合液的組分與體積分別為：ROX Mix （2 x） 10 μL，PCR上下游引物（10 μmol·L?1）各0.6 μL，cDNA 2 μL，剩余體積用ddH2O補足。以水稻actin基因（Os03g0718150）作為內參。qRTPCR得到的結果用相對定量的方法進行分析[19]。

2 結果與分析

2.1 9311和內江P164的農藝性狀統計

為了更好地了解內江P164和9311的生長特性，對2019年晚季種植于南靖基地大田的簇生穗品種內江P164和單粒稻9311的農藝性狀進行統計。統計結果發現，相比于9311，簇生穗品種內江P164的株高和穗長大于9311，一次枝梗數、二次枝梗數、主穗粒數和著粒數密度均低于9311，內江P164的穗發育異常主要體現在二次枝梗長度縮短且數目減少（表1）。

表 1 9311和內江P164的農藝性狀比較Table 1 Agronomic characteristics of 9311 and Neijiang P164

2.2 幼穗發育不同時期OsCl-6的表達量分析

目前國際上公認的水稻花序發育過程分為9個時期，在第1～5時期表達的基因主要影響花序的枝梗發育，而在第6～9時期表達的基因則影響穎花的形成[20]。從內江P164的簇生穗形態上判斷，一次枝梗發育并無明顯異常，而二次枝梗則較短且較少。為了更清楚地檢測OsCl-6在穗發育不同時期的表達情況，分別取種植于網室大田的9311和內江P164的如下幾個時期的幼穗：（1）spl1：主穗軸形成期，莖頂端還未見白須尖，（2）spl2-4：一次枝梗原基形成和伸長期，莖頂端略見些許毛茸茸，幼穗長度小于2 mm，（3）spl5-6，莖頂端明顯毛茸茸，幼穗長度約2～5 mm，（4）spl7-8：幼穗長度為1～2 cm，分別進行RNA提取、cDNA反轉錄及qRT-PCR分析。qRT-PCR結果顯示，簇生穗基因OsCl-6在幼穗發育過程中表達量先有一個逐步上調的過程，在二次枝梗形成和分化的第5～6階段表達量達到最高，隨后表達量開始下調，且在所取的幼穗發育4個時期中的表達量在內江P164中均顯著高于93-11（圖1），這預示簇生稻內江P164的二次枝梗發育異常很可能直接受OsCl-6的表達量調控，OsCl-6的表達量顯著上調或直接抑制其二次枝梗發育。

圖 1 幼穗發育不同時期OsCl-6的表達量分析Fig. 1 Expression of OsCl-6 in young panicles at developmental stages

2.3 細胞周期相關基因的表達分析

由于內江P164和9311的穗形態差異主要體現在二次枝梗的長度和數目上，內江P164的二次枝梗縮短且數目明顯較少，植物器官異常發育常常與細胞周期調控直接相關，為研究內江P164和9311中細胞周期關鍵基因的表達是否存在顯著差異，本研究選取內江P164和9311的2～5 mm幼穗樣品對28個細胞周期關鍵基因的表達量進行了qRT-PCR分析。結果顯示，28個細胞周期關鍵基因中大部分基因的表達量都較高，這也預示著在幼穗發育時期中這些基因是高度活躍的，CAK1A、CDKA1、CDKC;2、CDKE和CDKF;1等細胞周期依賴激酶（CDKs）在9311中的表達高于內江P164，而CYCB2;1、CycB2;2和CycB1;1等B類細胞周期蛋白（cyclin）則在內江P164中的表達高于9311（圖2）。CDKs是一組具有特征性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，協同周期蛋白cyclin，通過對絲氨酸/蘇氨酸蛋白的化學作用驅動細胞周期，能在所有真核細胞中調控細胞周期的整個過程，其活性既受與之結合的cyclin的調節，又和特異的磷酸化和去磷酸化有關[14]。內江P164的簇生穗表型或受CDKs的表達量顯著下調及B類cyclin的表達量顯著上調直接調控。

圖 2 幼穗中細胞周期相關基因的表達分析Fig. 2 Expressions of cell cycle-related genes in young panicle

2.4 穗發育相關基因的表達分析

植物中常常存在一個基因可影響許多性狀的發育而引起多方面表型效應的現象，并且單個性狀的發育也通常是由多個基因控制的一系列生化過程連續作用的結果。水稻中常常存在多個基因共同對穗發育的某個節點起調控作用最終導致穗發育的異常[11?13]。Jiang等[9]通過RT-PCR發現，相比于野生型9311，簇生穗突變體sped1-D中穗發育相關基因Lax1、OsWOX3、RFL、Rf-1L等的表達量均顯著下調。為進一步探索簇生穗基因OsCl-6和水稻中其他穗發育尤其是枝梗發育相關基因的關系，我們分別對9311和內江P164的2～5 mm幼穗中與穗發育尤其是枝梗發育相關的基因的表達量進行qRT-PCR分析。分析結果表明，OsCl-6、MFS1、Rf-1L、OsREL2和CL-4等基因在幼穗中的表達量較高，而OsWOX3、RFL、Lax、Lax2、FZP和MFS2等基因則在幼穗中表達量較低，且OsWOX3、Lax1、FZP和MFS2在簇生穗材料內江P164的表達量顯著低于9311，MFS1在簇生穗材料內江P164的表達量顯著高于9311，而Rf-1L、OsREL2、RFL和Lax2的表達量在9311和內江P164無顯著差異（圖3）。因此OsCl-6或和上述表達量有顯著差異的基因直接或間接的協同對水稻的枝梗發育起調節作用。

圖 3 幼穗枝梗發育相關基因的表達分析Fig. 3 Expressions of panicle branch development-related genes in young panicle

3 討論與結論

近些年來，以常規途徑直接增加穗粒數和穗密度來實現增產難度越來越大。通過聚合簇生性狀或調控穗特異表達基因來增加穗粒數和穗密度不失為一個可以嘗試的手段。育種家也一直在摸索利用簇生稻資源來創造水稻新品種。李經勇等[21]將稗草總DNA通過花粉管通道法導入水稻恢復系渝恢1351并從中選取優質后代再結合傳統雜交手段創制了一批具有簇生穗表型是優良恢復系。利用具有頂小穗3粒簇生的常規中秈稻突變體和常規早秈稻雜交、后代復交、并經世代選育，俞法明等[22]獲得較對照增產的頂小穗2～5粒簇生的常規早秈稻新種質。但目前在簇生稻品種的選育上還沒有明顯的進展與突破。一方面與大部分簇生穗種質資源常常伴隨結實率偏低有關，另一方面有關簇生穗形成的分子機理還尚未闡明，無法在生產中提供相應的指導。目前已發現的簇生穗突變體多數還伴隨枝梗和穎殼發育異常、育性降低等其他表型。我們推測簇生穗調控基因很可能和其他穗發育相關基因直接或間接關聯協同調控水稻的穗發育，目前已分別有具體的研究表明水稻中根、分蘗、籽粒形狀、花粉育性等因某個細胞周期相關基因異常而直接影響導致對應的組織發育異常，而穗發育處于上述組織發育的中間階段，因而推斷枝梗發育極有可能也直接受到細胞周期的影響。目前水稻中還沒有關于枝梗發育與細胞周期直接相關的研究。Fouad利用硅酸鹽分析方法，對水稻9個不同稻屬的CDKA編碼基因及其對應蛋白進行了鑒定，發現其中的Brachyantha具有一個修飾的SUC/CKS （CDC2/cyclin依賴性激酶調節亞基抑制因子）結合基序，并提出觀察到的這個變異可以通過傳統育種或分子方法來操縱細胞分裂和栽培水稻品種的生長[23]。本研究探索通過對穗發育尤其是枝梗發育相關基因及細胞周期相關基因的表達量進

行分析，內江P164中CDKs的表達量顯著下調而B類cyclin的表達量顯著上調，CDKs能在所有真核細胞中調控細胞周期的整個過程，其活性既受到和它結合的cyclin的調節，又與特異的磷酸化和去磷酸化有關，因而推測內江P164的簇生穗表型很有可能也與磷酸化相關。后續可以進一步通過磷酸化途徑入手，深入對這些差異基因深入研究，驗證其在簇生穗形成中的具體功能，將有助于進一步闡明簇生穗的形成分子機理，為簇生稻遺傳育種提供參考。