巨尾桉EuDQD/SDH5 基因的克隆與表達(dá)分析

王 梅，趙艷玲

（華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021）

【研究意義】莽草酸脫氫酶（Shikimate dehydrogenase,SDH）催化3-脫氫莽草酸（3-DHS）加氫合成莽草酸（SA）或脫氫形成沒(méi)食子酸（GA）［1］。脫氫奎尼酸脫水酶（Dehydroquinate dehydratase,DQD）負(fù)責(zé)催化3-脫氫奎尼酸向3-脫氫莽草酸轉(zhuǎn)化的可逆反應(yīng)。植物莽草酸途徑中的SDH 與DQD 形成二聚體復(fù)合酶DQD/SDH［2］，這些次生代謝物是木質(zhì)素、凝聚型丹寧、原花青素類(lèi)等物質(zhì)的合成前體［3］。桉樹(shù)是重要的紙漿材樹(shù)種，水解單寧占桉木多酚類(lèi)化合物的5.98%，而縮合單寧占1.91%［4］，單寧在酸、堿、酶條件下都不易水解，工業(yè)造紙上利用濃硫酸將縮合單寧縮合成不溶于水的分子［5］。開(kāi)展桉樹(shù)木材多酚類(lèi)的分子調(diào)控機(jī)理研究，對(duì)培育低多酚的紙漿林品種、降低造紙污染具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】SDH 家族具有高度保守的α/β 折疊三維結(jié)構(gòu)，因活性位點(diǎn)殘基和幾何結(jié)構(gòu)的輕微不同而具有不同的底物特異性［6］。在植物中，SDH 通過(guò)N 端與DQD 結(jié)合，形成DQD/SDH 復(fù)合酶。植物中SDH基因的沉默會(huì)影響植物莖高生長(zhǎng)以及造成芳香族氨基酸缺乏等現(xiàn)象［7］。目前已經(jīng)分離得到白楊［8］、擬南芥［9］、番茄［10］、煙草［7,11］、葡萄［12］、山茶［13］、赤桉［14］、石榴［15］等植物中的DQD/SDH基因。不同植物因生理特性不同具有不同的DQD/SDH基因種類(lèi)，目前已發(fā)現(xiàn)擬南芥編碼1 個(gè)DQD/SDH基因［8］，白楊編碼5 類(lèi)DQD/SDH基因［8］，葡萄、赤桉、石榴、山茶等編碼4 類(lèi)DQD/SDH基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】桉樹(shù)的多酚類(lèi)物質(zhì)含量較高，推測(cè)桉樹(shù)SDH基因家族更加復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)4 個(gè)桉樹(shù)SDH家族基因，但與木質(zhì)素合成相關(guān)的桉樹(shù)SDH研究較少。本研究根據(jù)桉樹(shù)基因組數(shù)據(jù)分離桉樹(shù)DQD/SDH基因，通過(guò)分析木質(zhì)素含量不同的轉(zhuǎn)基因桉樹(shù)植株的DQD/SDH基因表達(dá)量，探究DQD/SDH酶與木質(zhì)素合成的相關(guān)性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分析巨尾桉SDH 家族EuDQD/SDH5 的酶動(dòng)力學(xué)和表達(dá)特性，探究EuDQD/SDH5 與木質(zhì)素生物合成的關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步解析巨尾桉多酚類(lèi)物質(zhì)的合成途徑提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生巨尾桉組培苗［16］、轉(zhuǎn)基因盆栽苗（過(guò)表達(dá)CuZnSOD 的P40、P41［18］，過(guò)表達(dá)CuZnSOD+反義4CL1基因的F52、F71、F76［19］）、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21均為華僑大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。pMD-18T Vector、PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、Takara miniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、Takra MiniBEST Plant RNA Extraction Kit、One Step SYBR?PrimeScripTMPLUS RTPCR Kit，以及TaqPlus DNA polymerase、Bam?、Hind Ⅲ、DNA ligase 等均購(gòu)自大連寶生物公司，Poly（A）mRNA 純化試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，His-tag Protein purification Kit購(gòu)自常州天地人和生物科技有限公司。其他常規(guī)試劑購(gòu)自廈門(mén)綠茵試劑玻儀有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因克隆 提取巨尾桉葉片總RNA，具體操作方法參照文獻(xiàn)［17］。依據(jù)巨桉預(yù)測(cè)的DQD/SDH基因（GenBank 登錄號(hào)：XM_010026815.1）設(shè)計(jì)引物克隆巨尾桉DQD/SDH基因，引物為DQD/SDH5F：5'ATGACTCTCA GCAG CATCCC 3'，DQD/SDH 5R：5'-TCAACTGTTCTTCACCAATG 3'。獲得的目的片段與pMD18-T Vector 連接，PCR 篩選陽(yáng)性克隆子。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 委托華大基因公司測(cè)序克隆序列，在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)基因序列。通過(guò)ExPASy（http://www.expasy.org/）預(yù)測(cè)DQD/SDH 蛋白質(zhì)的生物化學(xué)性質(zhì)和功能特征，Swissmodel（http://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)DQD/SDH蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/ Tools/InterProScan/）預(yù)測(cè)DQD/SDH 蛋白質(zhì)家族和功能結(jié)構(gòu)域，利用軟件MEGA5.2 構(gòu)建鄰接樹(shù)。

1.2.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建與酶活性測(cè)定設(shè)計(jì)引物EuDQD/SDH5F：5'GGATCCATGACTC TCAGCAGCATCCC 3'，EuDQD/SDH5R：5'AAGCTTTCAACTGTTCTTCACCAATG 3'，亞克隆獲得具有BamH ?和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的陽(yáng)性PCR克隆質(zhì)粒，用BamH ?和Hind Ⅲ雙酶切原核表達(dá)載體pET-32a和亞克隆載體，連接目的片段篩選獲得pET-EuDQD/SDH5，按照文獻(xiàn)［7］［11］的方法，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)IPTG誘導(dǎo)的融合蛋白的表達(dá)。收集誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的菌液，加入4 mL裂解液，懸浮菌體并放置冰中1 h，通過(guò)超聲波震碎機(jī)充分裂解樣品，取上清。通過(guò)Ni-NTA beads 6FF親和純化His6標(biāo)記的重組蛋白，用250 mmol/L咪唑（pH 8）洗脫His6標(biāo)記的重組蛋白，利用Bradford法測(cè)定蛋白含量。以莽草酸為底物、NADP+為輔因子，在pH 7條件下，分析波長(zhǎng)340 nm處NADHP在酶反應(yīng)5 min內(nèi)的吸光度變化，采用軟件OriginPro 8.5中Michaelis-Menten線(xiàn)性擬合計(jì)算最大速率Vmax和米氏常數(shù)Km，Kcat/Km評(píng)估酶在植物體內(nèi)的催化效率。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR 利用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)野生巨尾桉組培苗的3 個(gè)植物組織（根、莖、葉）、野生巨尾桉盆栽苗不同節(jié)間（第一節(jié)、中間節(jié)、最低節(jié)）的葉片，以及本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化篩選獲得木質(zhì)素含量降低和不變的巨尾桉轉(zhuǎn)基因植株［18-19］的EuDQD/SDH5表達(dá)模式。參照Takara MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提取總RNA。以巨尾桉18S rRNA 為內(nèi)參基因，使用One Step SYBR?PrimeScripTMPLUS RT-PCR Kit 對(duì)目的基因及內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增，Eg18S3：5'CATGGCCGTTCTTAGTTGGT 3'，Eg18S4：5'TAGCA GGCTGAGGTCTCGTT 3'，EuDQD/SDH5（1）:5'CCCAATAGCCAAGGCCATAG 3'，EuDQD/SDH5（2）:5'GCT CCATTTGA AGCTCGGAC 3'，反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)［17］，重復(fù)測(cè)定3 次，按照相對(duì)定量法計(jì)算EuDQD/SDH5基因表達(dá)量：

式中，Ctts為實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct 值，Ctns為實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct 值；Cttc為對(duì)照組目的基因Ct 值，Ctnc為對(duì)照組內(nèi)參基因Ct 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨尾桉EuDQD/SDH5 基因克隆

提取巨尾桉葉片總RNA 并純化獲得mRNA，通過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增獲得巨尾桉EuDQD/SDH基因如圖1 所示，用凝膠回收1 500 bp 處的DNA 片段并與pMD-18T 連接，PCR 篩選陽(yáng)性克隆子，結(jié)果如圖2 所示，選擇第4、6、9、10 號(hào)菌株委托華大基因公司測(cè)序，第 6、9、10 號(hào)菌株的測(cè)序結(jié)果和巨桉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)基因（GenBank 登錄號(hào)：XM_010026815.1）具有同源性，相似性分別為98.75%、98.94%和98.94%。

圖1 RT-PCR 擴(kuò)增巨尾桉EuDQD/SDH 基因電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretic results of RT-PCR amplification of EuDQD/SDH gene from Eucalyptus grandis × E.urophylla

圖2 pMD-EuDQD/SDH5 質(zhì)粒PCR 驗(yàn)證電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic result of plasmids PCR verification of pMD-EuDQD/SDH5

2.2 巨尾桉EuDQD/SDH5 的生物信息學(xué)分析

由1 對(duì)引物克隆得到3 條同源性極高的同源序列，全長(zhǎng)均為1 599 bp，編碼532 個(gè)氨基酸，分別命名為EuDQD/SDH5-6（GenBank 登錄號(hào)：KY401151.1）、EuDQD/SDH5-9（GenBank 登錄號(hào)：KY401150.1）、EuDQD/SDH5-10（GenBank登錄號(hào)：KY401149.1），其中EuDQD/SDH5-6 與EuDQD/SDH5-10存在7 bp 差異，EuDQD/SDH5-6與EuDQD/SDH5-9存在8 bp 差異，EuDQD/SDH5-9與EuDQD/SDH5-10存在9 bp 差異；3 個(gè)基因編碼的蛋白分子質(zhì)量分別為57.24、57.3、57.41 ku，等電點(diǎn)分別為6.83、6.42、6.40。通過(guò)在線(xiàn)IterPro預(yù)測(cè)基因編碼蛋白功能，3 個(gè)蛋白均具有脫氫奎尼酸脫水酶和NADP+為輔因子的莽草酸脫氫酶功能，包含4 類(lèi)保守序列：醛縮酶類(lèi)? 超家族、莽草酸脫氫酶超家族、NADB Rossmann〔Rossmannfold NAD（P）+binding protein〕超家族和DHQD（Dehydroquinate dehydratase）第一類(lèi)酶。利用Swiss-model 同源建模蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)表明，3 種蛋白在結(jié)構(gòu)上屬于雙功能DQD/SDH，其中SDH 酶通量高于DQD 酶通量。這3 個(gè)蛋白除了在二聚體結(jié)合位點(diǎn)稍有不同，其中DQD/SDH5-6 由原來(lái)的187Glu 替換成186Phe，在輔因子結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基則完全相同。

利用MEGA5.2 對(duì)擬南芥、白楊、葡萄、巨桉等的DQD/SDH 基因建鄰接樹(shù)，結(jié)果（圖3）表明EuDQD/SDH5-6（簡(jiǎn)稱(chēng)EU5-6）、EuDQD/SDH5-9（簡(jiǎn)稱(chēng)EU5-9）、EuDQD/SDH5-10（簡(jiǎn)稱(chēng)EU5-10）與VvSDH4、EgSDH2基因序列相似性為77%，預(yù)測(cè)EuDQD/SDH5可能具有典型的DQD/SDH 活性，催化3-DHQ 到3-DHS 的脫水反應(yīng)以及3-DHS 到SA 的氧化還原反應(yīng)。

圖3 植物DQD/SDH 鄰接樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining tree of plant DQD/SDH5

2.3 原核表達(dá)載體PET-EuDQD/SDH5 的構(gòu)建與表達(dá)

BamH?/Hind Ⅲ雙酶切包含EuDQD/SDH5-6、EuDQD/SDH5-9、EuDQD/SDH5-10的DNA 序列和原核表達(dá)載體PET32a，構(gòu)建重組載體PETEuDQD/SDH5-6，PET-EuDQD/SDH5-9，PETEuDQD/SDH5-10，雙酶切重組載體質(zhì)粒的電泳結(jié)果（圖4）表明，在1 500 bp 處有目的基因條帶，委托華大基因測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明載體構(gòu)建成功。

圖4 重組載體PET-EuDQD/SDH5 的BamH?/HindⅢ雙酶切電泳結(jié)果Fig.4 Double enzyme digestion of recombinant vector PET-EuDQD/SDH5 by BamH?/Hind Ⅲ

參照文獻(xiàn)［8］［12］進(jìn)行ITPG 誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。3 個(gè)EuDQD/SDH5基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)? 599 bp，編碼532 個(gè)氨基酸，表達(dá)57 ku 左右的蛋白，另加表達(dá)載體的融合蛋白，預(yù)計(jì)蛋白條帶在60～70 ku 附近，如圖5 所示，與對(duì)照組相比，在70 ku 附近有明顯的蛋白條帶，說(shuō)明目的蛋白在大腸桿菌中有表達(dá)。

圖5 重組蛋白原核表達(dá)的SDS-PAGE 電泳結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE electrophoretic results of prokaryotic expression of recombinant protein

2.4 重組蛋白EuDQD/SDH5 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

用250 mmol/L 咪唑（pH 8）洗脫His6 標(biāo)記的重組蛋白，測(cè)定輔因子為NADP+、底物為莽草酸（SA）的酶催化反應(yīng)，從表1 可見(jiàn)，EuDQD/SDH5-9 和EuDQD/SDH5-10 對(duì)底物SA 的親和力較大，且在植物體內(nèi)的催化效率較高，但EuDQD/SDH5-6 對(duì)底物SA 在植物體內(nèi)的催化效率較低，這可能與其二聚體結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)氨基酸位置變化有關(guān)，由原來(lái)的187Glu 替換成186Phe。

表1 EuDQD/SDH5 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)（輔因子NADP+、底物SA）Table 1 Kinetic properties of EuDQD/SDH5（co-factor NADP+,substrate SA）

2.5 EuDQD/SDH5 在巨尾桉的表達(dá)模式

EuDQD/SDH5的3 個(gè)基因存在7～9 bp 的差異序列，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在EuDQD/SDH5特異性最強(qiáng)的200 bp DNA 片段中，3 個(gè)基因的序列完全相同，因此熒光定量PCR 所檢測(cè)的EuDQD/SDH5的特異性片段表達(dá)量是3 個(gè)基因的總表達(dá)量。采用2-??Ct相對(duì)定量法以18S 為內(nèi)參基因，熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)EuDQD/SDH5基因在巨尾桉組培苗不同組織中（根、莖、葉片）的表達(dá)模式。EuDQD/SDH5在葉片中表達(dá)量最高，莖中表達(dá)量稍低，根系表達(dá)量最低，葉片表達(dá)量約是根部表達(dá)量的9 倍。在不同節(jié)間葉片中的表達(dá)量也有差異（表2），EuDQD/SDH5在上層幼葉中表達(dá)量最高，在中間節(jié)間和下層葉片中表達(dá)量都低，EuDQD/SDH5在上層幼葉中的表達(dá)量是其他節(jié)間葉片表達(dá)量的7 倍左右。

表2 EuDQD/SDH5 基因在巨尾桉中的表達(dá)定量分析Table 2 Quantitative analysis of expression of EuDQD/SDH5 gene in Eucalyptus grandis × E.urophylla

EuDQD/SDH5基因?qū)儆诿Р菟崦摎涿讣易宓牡? 類(lèi)，屬于同一分類(lèi)的白楊DQD/SDH2（poptr5）主要在木質(zhì)化組織中表達(dá)，可能與木質(zhì)素的合成相關(guān)［8］。利用本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化獲得的硫酸木質(zhì)素含量改變的轉(zhuǎn)基因巨尾桉溫室苗植株（過(guò)表達(dá)CuZnSOD 的P40、P41［18］，過(guò)表達(dá)CuZnSOD+反義4CL1基因的F52、F71、F76［19］），研究EuDQD/SDH5基因在葉片中的表達(dá)量變化，以野生型巨尾桉葉片EuDQD/SDH5基因的表達(dá)量為對(duì)照。其中P40 和F52 的硫酸木質(zhì)素含量分別比對(duì)照增加2%和減少1.07%，P41、F71 和F76 的硫酸木質(zhì)素含量分別比對(duì)照減少55.48%、41.81%、38.68%。從圖6 可見(jiàn)，5 株轉(zhuǎn)基因植株葉片的EuDQD/SDH5基因表達(dá)量均低于野生株系，其中轉(zhuǎn)基因植株P(guān)41、F71 和F76 的EuDQD/SDH5基因表達(dá)量均降低，暗示EuDQD/SDH5的低表達(dá)可能與木質(zhì)素的生物合成有關(guān)，但是轉(zhuǎn)基因株系F52 中該基因表達(dá)量也降低，木質(zhì)素含量減少較小，說(shuō)明莽草酸脫氫酶家族有多個(gè)酶為木質(zhì)素生物合成提供前體物質(zhì)。

圖6 巨尾桉轉(zhuǎn)基因植株葉片的EuDQD/SDH5 基因表達(dá)分析Fig.6 Quantitative analysis of expression of EuDQD/SDH5 gene in leaves of transgenic Eucalyptus grandis × E.urophylla

3 討論

Bontpart 等［12］將雙子葉植物的DQD/SDH 分成5 類(lèi)，第4 類(lèi)是VvSDH4和poptr5，序列相似性為77%。本研究克隆巨尾桉的3 個(gè)基因同屬于第4 類(lèi)，都具有典型的SDH 活性，但對(duì)底物莽草酸的親和力不同，其中EuDQD/SDH5-10 對(duì)莽草酸的親和力和催化效率均最高。根據(jù)生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)，3 個(gè)蛋白在輔因子結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基完全相同，只有在二聚體結(jié)合位點(diǎn)稍有不同，EuDQD/SDH5-6 由原來(lái)的187Glu 替換成186Phe，這可能導(dǎo)致EuDQD/SDH5-6 在植物體內(nèi)的催化效率比EuDQD/SDH5-10 和EuDQD/SDH5-9 低。

巨尾按EuDQD/SDH5在幼葉和莖中的表達(dá)量較高，暗示EuDQD/SDH5 在莽草酸合成途徑中主要承擔(dān)生長(zhǎng)發(fā)育旺盛器官的芳香族氨基酸合成以及酚酸類(lèi)物質(zhì)合成等。屬于同一分類(lèi)的白楊的DQD/SDH2（poptr5）主要在木質(zhì)化組織中表達(dá)，可能與木質(zhì)素的合成相關(guān)［8］。葡萄VvSDH4在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育期間表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，在葡萄漿果開(kāi)始著色成熟期之前表達(dá)量最高［12］。這些研究結(jié)果與本研究中EuDQD/SDH5在巨尾桉中表達(dá)量的研究結(jié)果相契合。本研究3 個(gè)基因在木質(zhì)素含量低的轉(zhuǎn)基因巨尾桉中的表達(dá)量也較低，說(shuō)明該基因的表達(dá)與木質(zhì)素的合成有一定關(guān)聯(lián)性，但木質(zhì)素的生物合成途徑復(fù)雜［20］，轉(zhuǎn)基因F52 植株的木質(zhì)素含量?jī)H降低約1.07%，而EuDQD/SDH5基因表達(dá)量降低約63%，這暗示有多個(gè)莽草酸脫氫酶為木質(zhì)素的生物合成提供酚類(lèi)化合物。

本研究分離的巨尾桉EuDQD/SDH5基因與赤桉EuDQD/SDH2基因相似性為98.81%，赤桉的EcDQD/SDH2 和EcDQD/SDH3 兩種酶均可催化依賴(lài)NADP+的3-脫氫莽草酸氧化生成沒(méi)食子酸［14］，沒(méi)食子酸為水解單寧提供酚酸，是赤桉鋁離子耐受性高的原因之一。有關(guān)莽草酸脫氫酶家族的研究尚處于起步階段，繼續(xù)開(kāi)展DQD/SDH5 催化3-脫氫莽草酸生成沒(méi)食子酸酶動(dòng)力學(xué)研究，通過(guò)該基因在桉樹(shù)中過(guò)量表達(dá)或者阻斷表達(dá)進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能，為桉樹(shù)莽草酸脫氫酶家族的研究提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

本研究分離得到巨尾桉3 個(gè)EuDQD/SDH5基因，全長(zhǎng)均為1 599 bp，EuDQD/SDH5-6與EuDQD/SDH5-10存在7 bp 差異，EuDQD/SDH5-6與EuDQD/SDH5-9存 在8 bp 差 異，EuDQD/SDH5-9與EuDQD/SDH5-10存 在9 bp差異，EuDQD/SDH5-6 由原來(lái)的187Glu 替換成186Phe，但是輔因子結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基則完全相同。3 個(gè)EuDQD/SDH5基因的表達(dá)蛋白均具有酶活性，EuDQD/SDH5-10對(duì)莽草酸的親和力和催化效率都最高。巨尾桉EuDQD/SDH5基因在幼葉和莖中表達(dá)水平高，推測(cè)可能與木質(zhì)素的合成相關(guān)。