四川地區豬源戊型肝炎病毒感染的分子流行病學調查

張毅，陳斌，梁璐琪，邵靚，周明忠，裴超信，陳弟詩，丁夢蝶，陳冬

(四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041)

戊型肝炎是一種人畜共患傳染病，由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)引起，人的發病以青壯年為主，病程4～6 周，死亡率0.5%～3%，臨床可表現從亞臨床感染到重度肝炎，對妊娠、慢性肝病、免疫缺陷、器官移植等特殊人群威脅重大[1]。對人易感的HEV僅有1個血清型，4個基因型[2]，其中基因1型、2型僅感染人，基因3型、4型則可感染人和豬、鼠等多種動物。豬是HEV主要的儲存宿主和傳染源，其感染HEV時不產生明顯臨床癥狀和病變，豬源HEV可能通過食用未煮熟的豬肉產品[3]、長期的職業暴露(屠宰場工人[4]、獸醫[5])等途徑傳播給人，對于公共衛生安全是一種嚴重的潛在威脅。

HEV基因組全長約7.2 kb，目前已發現4個開放閱讀框(open reading frame, ORF)。ORF1主要編碼復制相關的非結構蛋白；ORF2和ORF3由病毒亞基因組的可選閱讀框產生，分別編碼衣殼蛋白和小免疫磷蛋白，ORF2編碼的衣殼蛋白含有重要免疫表位，后者與細胞骨架相關；ORF4只在基因1型中發現，編碼區位于ORF1內部，編碼蛋白通過形成蛋白復合物參與病毒的復制[6]。

為了解四川豬源HEV流行特征，本研究對四川部分地區的屠宰場生豬進行HEV監測，并對HEV編碼衣殼蛋白的ORF2部分序列進行同源性和系統進化分析，為HEV的防控策略提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2019年在四川省13個地區屠宰場采集的豬組織樣品(淋巴結、肝)358份，-20 ℃保存。

1.2 主要試劑

MagMAXTMPathogen RNA/DNA Kit總核酸提取試劑盒，購自Thermo Fisher Scientific 公司; One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、Tks GflexTMDNA Polymerase、DL2000 DNA Marker等，購自寶日醫生物技術有限公司。

1.3 引物、探針的設計與合成

熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測：參照文獻[7]建立的方法進行。

套式RT-PCR(RT-nPCR)：根據GenBank中3型與4型HEV基因組序列，進行核苷酸比對分析，在HEV ORF2的保守區設計2對套式PCR引物HEV-out-F和HEV-out-R、HEV-in-F和HEV-in-R，終產物為ORF2 5′端長度為1 020 nt的部分序列(去除兩端引物后為977 nt)。引物、探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，詳見表1。

表1 HEV檢測和序列擴增所用引物、探針

1.4 樣品前處理

將每份樣品的淋巴結、肝各剪取約0.01 g，混合后放入裂解介質管，加入800 μL PBS，使用組織勻漿儀勻漿1 min，8 000 r/min 離心2 min，取組織上清液200 μL進行總核酸提取。

1.5 核酸提取

使用MagMAXTMPathogen RNA/DNA Kit總核酸提取試劑盒，配合自動核酸提取儀提取組織上清液中的總核酸。總核酸置-70 ℃保存。

1.6 HEV的qRT-PCR檢測

使用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)進行qRT-PCR檢測。反應體系為：10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，2×buffer 10 μL，反轉錄酶0.4 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，總核酸 2 μL，無核酸酶水4.7 μL。反應條件為：42 ℃，5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。出現特異性擴增曲線的樣品判定為陽性。

1.7 HEV ORF2部分序列的擴增

選出qRT-PCR陽性樣品的總核酸，使用設計的RT-nPCR方法分兩步進行擴增。首先使用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2進行一步法RT-PCR，反應體系為：10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，RT-PCR反應液10 μL，酶混合物0.8 μL，總核酸 2 μL，無核酸酶水5.2 μL。反應條件為：50 ℃，30 min；94 ℃，2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，35個循環。隨后用無核酸酶水對擴增產物進行100倍稀釋，作為第2輪擴增DNA模板。使用Tks Gflex DNA Polymerase進行第2輪PCR擴增，反應體系為：10 μmol/L上游引物2.5 μL，10 μmol/L下游引物2.5 μL，Gflex反應液25 μL，Gflex DNA聚合酶1 μL，DNA模板2 μL，無核酸酶水17 μL。反應條件為：94 ℃，1 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，68 ℃ 30 s，30個循環。取第2輪PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，成功獲得目的片段的樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司克隆測序。

1.8 HEV ORF2部分序列分析

將獲得的HEV ORF2部分序列提交GenBank，從GenBank中獲取禽源HEV 1株，HEV基因1、2、3、4型代表株26株，BLAST相似率最高的HEV毒株11株，共計38條HEV ORF2部分序列作為參考，使用Lasergene 7.0 的 MegAlign 模塊的Clustal W方法進行核苷酸比對分析(不包括禽源HEV)，使用MEGA 7.0進行Neighbor-Joining法系統進化分析。

2 結果與分析

2.1 屠宰場HEV核酸檢測

qRT-PCR檢測結果顯示，屠宰場豬組織樣品HEV總陽性率為4.75%(17/358)，61.54%(8/13)的地區有HEV陽性樣品檢出，不同地區陽性率為4.35%～44.44%。各地區檢測結果見表2。

表2 HEV檢測結果、陽性樣品的毒株命名及GenBank登錄號

2.2 ORF2部分序列RT-nPCR擴增

使用建立的RT-nPCR方法，17份陽性樣品的ORF2部分序列均成功擴增，見圖1。

2.3 HEV ORF2部分序列分析

2.3.1 同源性分析

17個四川HEV毒株的ORF2部分序列均長977 nt，與參考序列相比，未發生缺失和插入。提交GenBank，序列號為MT263364-MT263380。核苷酸比對分析發現，17個毒株序列之間同源率存在較大差異(85.4%～99.4%)。一些來自相同地區的毒株高度同源，如3個資陽株swSCzy2、swSCzy3、swSCzy4之間同源率高達99%～99.4%；但多數地區存在差異較大的毒株，如3個雅安株之間、資陽株swSCzy1和其他3個資陽株之間，同源性分別只有85.37%～87.5%和87.1%～87.4%。

M.DL2000 Marker；1～17.HEV陽性樣品的ORF2產物

將17個四川毒株與37個參考序列比較，同源率為76.4%～97%，其中swSCcd1與基因4d型的中國豬源毒株CHN-SD-sHEV同源率最高為97%，swSCbz1、swSCnc1均與基因1型的印度人源毒株IND-HEV-AVH5-2010同源率最低為76.5%。swSCnj1等8個毒株與4a亞型代表株JKO-ChiSai98C同源率較高(91.6%～92.6%)，swSCya2等3個毒株與4b亞型代表株CVS-Sie10同源率較高(94.6%～95.6%)，swSCcd1等6個毒株與4d亞型代表株CH-YT-1同源率較高(94.7%～95.9%)。17個毒株中，有10株與人源毒株同源率超過95%，有6株與人源毒株同源率高于豬源毒株，同源率在94.6%～96%之間，與豬源毒株同源率更高的有11株，同源率在94%～97%之間，詳見表3。

2.3.2 系統進化分析

如圖2所示，HEV基因1～4型形成4個主要的進化分支，1型和2型由人源HEV毒株組成，3型和4型由人源、猴源、豬源、藏豬源等毒株組成，17個四川毒株的ORF2部分序列分別處于基因4型中的4a、4b和4d亞分支，3個亞分支均同時包含人源、豬源HEV毒株。其中swSCnj1、swSCnj2、swSCzy2、swSCzy3、swSCzy4、swSCya3、swSClz1、swSCnj3等8株，與4a亞型代表株JKO-ChiSai98C處于同一亞分支，劃為4a亞型；swSCya2、swSCbz2、swSCzy1等3株與4b亞型代表株CVS-Sie10處于同一亞分支，劃為4b亞型； swSCcd1、swSCnc1、swSCbz1、swSCpzh1、swSCcd2、swSCya1等6株與4d亞型代表株CH-YT-1處于同一亞分支，劃為4d亞型。

表3 四川豬源HEV毒株同源性最高的豬源及人源HEV毒株

▲為本研究測定的毒株序列

3 討論

我國是戊型肝炎高發地區，自2001年以來，人感染戊型肝炎呈上升趨勢[8]。生豬是HEV的主要動物宿主和傳染源之一，四川地區一些屠宰場設施自動化程度、生物安全水平較低，人感染HEV的風險需要評估。因此，有必要對生豬的帶毒情況進行監測。由于抗體水平無法實時反映帶毒情況，本研究采用敏感性高的熒光RT-PCR方法進行檢測，結果表明四川13個地區中有8個地區的豬群存在HEV感染，地區分布較廣，總陽性率為4.21%。與中國不同地區豬群HEV陽性率差異較大(2.25%～46.7%)[9-13]的情況相似，四川省也表現出地區間陽性率差異大的特征，為0～44.44%。其中陽性率在前位的資陽市、成都市、內江市均是四川省生豬交易頻繁的地區，HEV陽性率可能與生豬流動頻率相關，但還需進一步收集證據。

我國豬群主要流行HEV基因4型，其中4a和4d占主導地位，基因3型和基因4型的其他亞型也有報道。對17株HEV ORF2部分序列進行分析，核苷酸同源性為85.4%～99.4%，均為基因4型，其中4a亞型8株，4b亞型3株，4d亞型6株，與中國現在流行趨勢一致[14-15]，而4b亞型也是四川[16]、廣西[10]、廣東[17]地區的優勢基因亞型。本研究發現的4a和4d亞型毒株與四川甘孜藏豬源HEV毒株有較高同源性，表明豬源HEV遺傳有較強的地域性特征。

目前已通過動物試驗證實，豬源基因3型、4型HEV可感染非人靈長類，人源基因3型、4型HEV也可感染豬。從人醫臨床上看，歐洲、美國等國家主要流行基因1、3型[18]；我國主要流行基因1、4型，其中4型又以4a、4d、4h亞型為主[19]，四川豬源HEV優勢亞型中的4a、4d與人源毒株亞型一致。本研究發現，17個四川豬源毒株中有10株與人源毒株同源率超過95%，有6株與人源HEV的同源率高于豬源，表明四川豬源HEV與我國主要流行的人源HEV遺傳關系密切，具有較大的人畜共患風險，應提高防范意識，有針對性、系統性地進行預防和控制。