低溫下AHLs對多級A/O工藝中好氧生物膜特性的影響

周榮煊,馬瀟然,李 軍*,張林華,張 晶,張亞超,韓 浩

低溫下AHLs對多級A/O工藝中好氧生物膜特性的影響

周榮煊1,馬瀟然1,李 軍1*,張林華2,張 晶1,張亞超1,韓 浩1

(1.北京工業大學城建學部,北京 100124；2.北京質寶信息科技有限公司,北京 102600)

針對低溫條件下多級A/O工藝出水氨氮容易超標問題,進行外源添加酰基高絲氨酸內酯類信號分子(AHLs)對低溫下多級A/O工藝好氧段生物膜特性的影響研究.結果表明:添加100nmol/L的己酰基高絲氨酸內酯(C6-HSL)后生物膜硝化效率提高了22.34%,十二烷酰基高絲氨酸內酯(C12-HSL)則將生物附著量提高了24.47%,且C6-HSL和C12-HSL對生物膜硝化效率和生物附著量的提高作用均具有長期性.這是因為C6-HSL能夠將低溫下好氧段生物膜硝化活性提高17.56%,而C12-HSL可以將胞外聚合物(EPS)中蛋白質(PN)的含量提高67.37%.此外,C6-HSL和C12-HSL均能促進對應信號分子的內源釋放,因此對生物膜硝化活性和附著性能具有長期積極影響.高通量測序分析表明C6-HSL可提高(亞硝化單胞菌)的豐度,故能提高R2中生物膜硝化活性;而外源添加C12-HSL對r(紅桿菌屬)豐度影響較大,這是實驗組R5生物膜EPS中PN含量增加的重要原因.

多級A/O；生物膜；低溫；群體感應

水中含氮污染物濃度過高容易導致水體富營養化,與傳統活性污泥法相比,多級A/O工藝具有有機負荷均勻,碳源利用充分,氧氣利用率高等優點[1].此外,采用生物膜形式可以富集世代周期較長的硝化細菌,并提高多級A/O工藝抗沖擊能力,但是在低溫條件下應用生物膜形式的多級A/O工藝面臨的瓶頸問題之一是低溫導致微生物活性降低(尤其是硝化細菌的活性在低溫條件下更容易被抑制),進而導致工藝硝化能力不足,嚴重影響工藝的脫氮效果.此外,低溫條件下微生物活性下降容易導致反應器生物量降低,從而影響污染物去除效果,因此探究可以提高低溫下多級A/O工藝硝化能力的方法具有重要實際意義.

群體感應(QS)是一種與細胞密度緊密相關的細胞交流方式,QS是指細菌向環境中分泌信號分子,當環境中信號分子濃度到達一定閾值后即可激活下游目標基因,從而調節細菌群體行為模式[2].N-酰基高絲氨酸內酯(AHLs)是由革蘭氏陰性菌分泌的一類信號分子,AHLs可以影響胞外聚合物(EPS)的合成、調整菌群結構、促進生物膜形成等[3],從而影響反應器處理效果.有關AHLs對生物膜的影響主要集中在生物膜形成階段[4].Tan等[5]發現在SBR反應器中外源添加皮摩爾濃度(10-12nmol/L)的AHLs可以促進復雜種群生物膜EPS合成,Hu等[6]研究發現在低溫(14℃)條件下向SBBR反應器投加50nmol/L的AHLs混合物可以縮短生物膜反應器啟動時間.然而污水廠中污染物的降解主要是靠成熟生物膜來完成的,但是有關群體感應對成熟生物膜的影響方式尚不明確.Wang等[4]通過調查實際污水處理廠成熟生物膜信號分子含量,發現成熟生物膜AHLs濃度與溫度呈負相關,與生物膜活性呈正相關. Li等[7]發現AHLs類信號分子可促進微生物附著生長,從而促進生物量增長.多級A/O工藝在低溫條件下存在微生物硝化能力不足、生物量下降等問題.因此研究如何通過群體感應提高低溫下多級A/O工藝好氧段生物膜硝化活性和生物附著能力對提高低溫條件下多級A/O工藝的污染物去除能力有重要意義.

本文研究對象為多級A/O工藝好氧區成熟生物膜.在低溫條件下通過外源添加不同種類的AHLs類信號分子,研究AHLs類型對低溫條件下成熟生物膜附著能力、硝化活性的影響,并探索其影響機理,以期為提高低溫條件下多級A/O工藝的脫氮性能提供理論參考及技術支撐.

1 材料與方法

1.1 多級A/O反應器

圖1 多級A/O反應器

1.進水泵;2.生活污水;3.A1室;4.O11室;5.O21室;6.A2室;7.O21室;8.O22室;9.A31室;10.O31室;11.O32室;12.二沉池;13.出水;14.硝化液回流;15.曝氣泵

多級A/O生物膜反應器如圖1所示.反應器材質為有機玻璃,長×寬×高=90cm×60cm×60cm,有效水深50cm,有效體積270L.反應器分9個隔室,以填充于琉璃球中的鮑爾環作為生物載體,反應器載體填充率100%.反應器好氧區采用曝氣盤曝氣,通過轉子流量計控制曝氣量,缺氧區采用潛水泵進行攪拌,缺氧區體積:好氧區體積均為1:2.控制反應器溫度為(10±1)℃.

1.2 多級A/O生物膜反應器啟動及運行工況

反應器進水為實際生活污水.接種污泥首先進行悶曝活化,再將進水量從20%起逐漸提高至100%,待污染物去除有一定效果后加入載體進行掛膜并控制曝氣量,約48d后生物膜基本成熟,反應器啟動成功.反應器穩定運行時期進出水主要指標和運行工況如表1,反應器穩定在運行時期硝化能力不足,氨氮去除率不足70%.

表1 多級A/O反應器進出水指標及工況

1.3 實驗裝置及運行

前期檢測發現反應器好氧區生物膜可分泌C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C10-HSL和C12-HSL類信號分子,故選用這幾種信號分子進行實驗.

圖2 批次實驗裝置

1.轉子流量計;2.曝氣盤;3.止回閥;4.曝氣泵

批次實驗裝置如圖2,SBR反應器有效體積4L.將穩定運行時期的多級A/O生物膜反應器一級好氧區填料取出,用自來水洗去表面基質殘留后放入各SBR反應器,填充率為50%,再注入模擬廢水4L,模擬廢水成分參考文獻[8].實驗設置對照組R0,進水不添加AHLs;實驗組R1、R2、R3、R4和R5,進水分別添加100nmol/L的C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C10-HSL和C12-HSL信號分子(sigma公司).

批次實驗運行條件如下:水力停留時間(HRT) 12h,換水率100%,通過低溫槽控制溫度為10℃,每天測量進出水氮素濃度,實驗進行20d后停止投加AHLs并維持原工況繼續運行10d.

1.4 分析方法

每天收集進出水樣品,根據標準方法[9]測定氨氮(NH4+-N)、亞硝酸鹽氮(NO2--N)和硝酸鹽氮(NO3--N)濃度,生物量測定參考文獻[10].所有數據均測量3次取平均值.

1.4.1 EPS提取和分析 采用熱提法分離總EPS[11],并做一些修正,具體步驟如下:首先用機械方法從填料上分離生物膜,在離心機(sigma)中4000r/min離心2min后倒掉上清液,加入PBS緩沖溶液至30mL,再放入60℃水浴箱水浴30min,之后將混合液在12000r/min下離心10min,用0.22μm微孔濾膜過濾上清液,濾后溶液即為總EPS.以葡萄糖為標準物,用蒽酮-硫酸法定量測量多糖.用改良Bradford法測定蛋白質.

1.4.2 三維熒光光譜分析(EEM) 采用熒光光譜儀(F-7000,日本日立)對胞外聚合物進行熒光光譜(EEMs)分析.設置激發波長(x)200～420nm,發射波長(m)240～600nm,間隔分別為5和2nm,激發光和發射光的狹縫寬度均為5nm,掃描前用超純水作為空白樣消除背景噪音及拉曼散射.

1.4.3 AHLs提取和檢測 在第30d提取各反應器生物膜中的AHLs.首先用機械方法剝離填料上的生物膜,然后4000r/min離心2min后除上清液,再將樣品重溶于20mL甲醇,在冰水浴中用20kHz,100W超聲處理20min以破碎細胞,再用0.22μm纖維素過濾器過濾,將濾后溶液在40℃氮氣條件下干燥,最后重溶于400μL甲醇中.樣品在檢測前需于-20℃條件下保存,AHLs檢測方法參考文獻[12].

1.4.4 微生物種群分析 實驗20d時收集各反應器的生物膜樣品.樣品用PBS緩沖溶液洗滌3次后送往上海生工生物工程技術服務有限公司,采用Illumina Miseq測序平臺進行高通量測序分析[13].

2 結果與討論

2.1 AHLs類型對反應器硝化效率的影響

a對照組;b添加C4-HSL;c添加C6-HSL;d添加C7-HSL;e添加C10-SHSL;f添加C12-HSL

僅在實驗第1～20d添加AHLs類信號分子,第20～30d則不再添加.結果如圖3所示,第20d時R2和R5出水氨氮分別為12.26和11.04mg/L,與對照組R0相比硝化效率分別提升22.34%和28.75%,表明低溫條件下C6-HSL和C12-HSL能顯著提高生物膜硝化效率.而R1、R3和R4出水氨氮濃度變化不明顯,說明低溫下C4-HSL、C7-HSL和C10-HSL對生物膜硝化效率影響微弱.實驗第20～30d期間未添加AHLs類信號分子,但R2和R5的出水氨氮基本維持在10～15mg/L,說明低溫(10℃)下投加C6- HSL和C12-HSL對反應器硝化效率的提高作用具有長期性.

2.2 AHLs類型對生物膜硝化活性和生物附著量的影響

2.2.1 AHLs類型對生物膜硝化活性的影響 如圖4,第20d時反應器R2的生物膜硝化速率為54.74mgNH4+-N/(gVSS·d),與對照組R0相比上升17.56%,說明C6-HSL顯著提高了生物膜硝化活性. C6-HSL側鏈較短,分子量較低而親水性較高,因此傳質性能強,能更有效刺激細胞活性,這是C6-HSL能提高R2硝化效率的重要原因.R4生物膜硝化速率為43.01mgNH4+-N/(gVSS·d),較R0下降7.63%,說明C10-HSL對生物膜硝化活性有輕微抑制作用. R1、R3和R5的生物膜硝化速率則基本穩定.雖然C4-HSL側鏈最短、分子量最低,但R1生物膜硝化速率無明顯變化,這可能是C4-HSL過低的分子量使得其在環境中更容易被降解,從而難以充分刺激細菌活性.實驗前后R5生物膜硝化速率無明顯變化,但是C12-HSL可顯著提高生物膜生物量(圖5),從而提高R5的硝化效率.

圖4 反應器第20d生物膜硝化速率

圖5 反應器第20d生物量

2.2.2 AHLs類型對生物膜附著量的影響 如圖5所示,與對照組R0相比,R5生物量提高了24.47%,表明低溫下C12-HSL可顯著增加生物膜生物量,這是R5硝化效率提高的重要原因.R3和R4的生物量分別提高了6.40%和7.99%,說明C7-HSL和C10- HSL對生物膜生物量有輕微促進作用.而R1和R2生物量變化較小,C4-HSL和C6-HSL對生物膜生物量的影響較微弱.實驗結果發現隨著投加AHLs側鏈長度的增加,反應器生物量大體呈上升趨勢.Li等[7]在硝化污泥中投加不含側鏈基團的AHLs時發現,隨著側鏈長度增加,污泥的粘附性增長越明顯.這與本研究結果基本一致.

2.3 AHLs類型對生物膜微生物群落和EPS的影響

圖6 實驗第20d時微生物屬水平豐度

2.3.1 AHLs類型對生物膜微生物群落的影響 實驗第20d時對各反應器生物膜進行高通量測序分析,如圖6所示,低溫下添加AHLs會顯著影響成熟生物膜的菌群結構:R2中屬于氨氧化細菌(AOB)的含量從0.10%上升至0.25%,說明低溫下C6-HSL對AOB的富集效果最明顯,這是R2硝化活性提高的主要原因.R5中的含量上升至0.22%,說明C12-HSL對AOB的富集也有一定促進作用,而R1、R3和R4中含量變化較小,C4-HSL、C7-HSL和C10-HSL對AOB富集作用較微弱.這與反應器的硝化實驗結果基本一致(圖3).上述結果表明C6-HSL和C12-HSL可不同程度上促進生物膜AOB的富集,從而提升硝化能力,而C4-HSL、C7-HSL和C10-HSL對生物膜AOB含量影響較輕微,因此,這3類AHLs信號難以提高生物膜硝化能力.而作為市政污水中常見的亞硝酸鹽氧化細菌(NOB)[22],其在R1～R5中的含量與在R0中含量(0.24%)相比變化較小,說明上述各類信號分子對NOB的調控作用較微弱.

信號分子對反應器主要菌種含量也有顯著影響.如表2所示,R1～R5生物膜中的、、含量較R0均有明顯上升. R5中含量上升至34.47%,變化最為顯著,這與反應器生物量變化趨勢一致.原因可能為能夠分泌EPS來輔助細菌附著生長,其含量上升有助于提高膜生物量[23].R1～R4屬于異養硝化菌的[24]含量分別上升至11.23%、5.97%、5.79%和11.01%,的富集有助于提高反應器硝化效果,但R5的含量僅為0.46%,說明C12-HSL對富集作用不明顯,其硝化效果的提升可能與其它硝化細菌有關,這與馮惠[25]的發現一致.所有類型信號分子均增加了含量,但該菌種并非群體感應或群體猝滅細菌.一些研究認為為一類特殊細菌,這類細菌雖然并沒有AHLs編碼基因但有lux-R編碼基因,所以能夠感應AHLs類信號分子而參與到群體感應中,所以會對AHLs含量變化產生反應[25-26].

表2 反應器第20d生物膜部分細菌含量(%)

2.3.2 AHLs類型對生物膜EPS的影響 EPS是生物膜重要特性之一,生物膜中的細菌通過分泌EPS來固定自身,EPS的含量及成分比對生物膜的物理特性和傳質能力都有影響[8].第20d時測定各反應器生物膜EPS含量,結果如圖7所示,與R0相比,R5生物膜EPS含量增加了56.97%,說明低溫下C12-HSL可顯著促進生物膜EPS含量.R2、R3和R4生物膜EPS含量分別增加了9.90%、15.65%和26.65%,說明C6-HSL、C7-HSL和C10-HSL對生物膜EPS含量也有一定促進作用.而R1的EPS含量下降了8.61%,說明C4-HSL對生物膜EPS含量有一定抑制作用.實驗結果發現低溫下生物膜EPS含量會隨著投加AHLs側鏈長度增長而增加.群體感應可以促進細菌分泌EPS從而粘連更多微生物,促使生物膜厚度增加[14-15].Wang等[16]也發現添加AHLs可以提高成熟生物膜中EPS的濃度.EPS的增加可提升成熟生物膜的生物量,但是,過厚的生物膜會導致傳質效果變差,從而降低細胞活性[17],然而在本實驗中,R5在生物量上升24.47%的前提下其生物膜硝化速率仍保持穩定,C12-HSL對反應器硝化效果提升作用最好.

EPS主要成分為多糖(PS)和蛋白質(PN),兩者含量和比值對EPS性質有很大影響.如圖7所示,與R0相比,R1中生物膜的PS和PN含量分別下降了19.75%和5.42%,說明低溫下C4-HSL對生物膜EPS中的PN和PS含量有不同程度抑制作用.PN與EPS疏水性緊密相關[18],它可以調節EPS表面電荷并與PS通過共價鍵形成穩定復合物,從而提高生物膜的穩定性[19].PS是一種親水性高分子聚合物[8],其長碳鏈骨架可提高EPS絮凝性,并充當EPS中細胞其他組分的骨干.PN和PS的減少不利于細菌附著生長,這是投加C4-HSL后R1生物量下降的重要原因.而R5生物膜EPS中的PN含量上升了67.37%,PS含量基本穩定,說明低溫下C12-HSL可以大幅提高生物膜中PN的含量,從而促進細胞附著生長,這是R5生物量比R0高24.47%的主要原因.R2～R4生物膜EPS中PN含量較R0分別上升了12.41%、18.77%和34.19%,說明低溫下C6-HSL、C7-HSL和C10-HSL也能一定程度上提高EPS中PN含量,所以R2、R3和R4的生物量出現不同程度增加.

圖7 第20d反應器生物膜EPS分析

a.對照組;b.添加C4-HSL;c.添加C6-HSL;d.添加C7-HSL;e.添加C10-SHSL;f.添加C12-HSL

波峰A、B分別代表酪氨酸類蛋白質和類色氨酸物質,屬于細胞代謝物[20].波峰C、D和E代表芳香族蛋白質物質,屬于細胞成分[21]

采用三維熒光(EEM)對EPS組分進行進一步分析.如圖8所示,與R0相比,R1的A峰基本穩定,新出現E峰說明其代謝活性變化不大但種群演替劇烈,結合R1硝化效果,說明C4-HSL對生物膜的種群結構影響大于細菌代謝活性影響.R2和R5的波峰B、C和D強度大幅增大,說明投加C6-HSL和C12- HSL后生物膜細菌生命活性更旺盛,細胞更替劇烈.R5的A峰消失而R2的A峰存在,說明C12-HSL對生物膜種群結構影響大于C6-HSL.R3和R4的A峰變化不大而C、D峰均有小幅上升,說明添加C7- HSL和C10-HSL后生物膜細胞代謝活性基本穩定但更替水平略有上升.

2.4 AHLs類型對內源信號分子釋放的影響

實驗第30d時測定R0～R5生物膜中AHLs含量,結果如圖9所示:添加C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C10-HSL和C12-HSL后R1～R5的該類AHLs濃度分別比R0高9.45,36.73,26.35,40.73和39.80ng/g,而其它類型AHLs濃度基本穩定.這表明外源添加AHLs對生物膜AHLs的內源釋放影響具有長期性,這是停止添加AHLs后反應器硝化效果還能持續維持的主要原因.低溫條件下添加上述幾類AHLs均能持續促進生物膜分泌對應種類信號分子,其中C10-HSL、C12-HSL、C6-HSL和C7-HSL促進作用較大,而C4-HSL促進作用較小,這可能是因為C4-HSL在多菌種復雜環境中穩定性不如其它信號分子,從而難以充分刺激細菌分泌C4-HSL.添加C4-HSL后R1生物膜EPS濃度下降了8.61%,AOB豐度和硝化效果變化均不明顯,說明C4-HSL對低溫下生物膜硝化能力影響微弱,不具備實際工程價值.

圖9 第20d反應器生物膜AHLs濃度

3 結論

3.1 低溫下外源投加合適類型的AHLs可促進成熟生物膜的硝化效果,其中C6-HSL主要通過提升生物膜硝化活性(17.56%)來實現,C12-HSL主要通過增加生物量(24.47%)來實現.

3.2 低溫下外源添加合適類型的AHLs可通過增加EPS中的蛋白質含量來提升生物膜附著性能,其中C12-HSL對EPS中蛋白質含量促進作用最明顯,可將蛋白質含量提升67.37%.

3.3 低溫下外源添加C6-HSL、C7-HSL、C10-HSL和C12-HSL可長期促進生物膜分泌對應AHLs,從而對反應器硝化性能產生持久影響.

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Effects of AHLs at low temperature on the characteristics of mature biofilms in aerobic zone of multi-stage A/O technology.

ZHOU Rong-xuan1, MA Xiao-ran1, LI Jun1*, ZHANG Lin-Hua2, ZHANG Jing1, ZHANG Ya-chao1, HAN Hao1,

(1.Faculty of Urban Construction of Beijing University of Technology, Beijing 100124, China；2.Beijing Zhibao Information Technology Co, Ltd, Beijing 102600, China)., 2021,41(5)：2311～2140

Aiming at the problem that the ammonia nitrogen in the effluent of the multi-stage A/O technology is likely to exceed the standard under low temperature conditions, the effect of exogenous addition of acyl homoserine lactone signal molecules (AHLs) on the characteristics of the biofilm in the aerobic zone of the multi-stage A/O technology at low temperature was studied. Results showed that the addition of 100nmol/L hexanoyl homoserine lactone (C6-HSL) increased the biofilm nitrification efficiency by 22.34%, and lauryl homoserine lactone (C12-HSL) increased the amount of attachment biomass by 24.47%, both C6-HSL and C12-HSL had long-term effects on the nitrification efficiency and biological adhesion of biofilm. This was because C6-HSL can increase the aerobic biofilm nitrification activity by 17.56% at low temperature, while C12-HSL could increase the content of protein (PN) in EPS by 67.37%. In addition, both C6-HSL and C12-HSL could promote the endogenous release of the same signal, thus having a long-term positive impact on the nitrification activity and adhesion performance of biofilm. The high-throughput sequencing analysis showed that C6-HSL can increase the abundance of, and thus enhancing the nitrification activity of biofilm in R2; while the addition of C12-HSL had a greater impact on the abundance ofwhich was an important reason for the increase of PN content in EPS of R5 biofilm.

multi-stage A/O technology；biofilm；low temperature；quorum sensing

X703 文獻識別碼：A

1000-6923(2021)05-2133-08

周榮煊(1995-),男,四川雅安人,北京工業大學碩士研究生,主要從事分段進水多級A/O工藝研究.

2020-09-08

水體污染控制與治理科技重大專項(2018ZX07701001-25)

* 責任作者, 教授, jglijun@bjut.edu.cn