氧化應激狀態下仔豬海馬差異表達miRNAs與轉錄組的關聯分析

張 晨，馮露秋，林海爛，黃子晴，王乃秀，甘 玲，2*

(1.西南大學動物醫學院，重慶 402460；2.重慶市獸醫科學工程研究中心，重慶 402460)

在動物養殖過程中，因營養、環境及管理不當等因素引起的氧化應激與仔豬疾病的發生發展密切相關[1-2]，極大地限制了畜牧業的發展。哺乳動物腦組織海馬體是參與應激調控的重要區域[3]，在應激條件下，腦海馬的背、腹側區域展示了不同的基因表達譜和功能特征[4]，對生命過程的參與及對外界的刺激有不同的響應和調節。如磷酸二酯酶11A4在嚙齒動物腹側海馬中的表達量為背側的3～10倍[5]；空間學習障礙與海馬背側病變呈正相關，卻與腹側的病變無顯著相關性[6]。

miRNA是哺乳動物腦組織中大量表達的內源性非編碼單鏈小RNA，主要通過和靶基因3′非翻譯區 (3′UTR) 結合，負向調節基因的表達[7]，參與生長、凋亡和應激等生物學過程，是生物基因網絡調控中的重要組成成分[8]。迄今，已從各種生物中鑒定出數百種不同的miRNA，開發了如Miranda、TargetScan等靶點預測軟件，以搜索miRNA潛在的靶基因[9]。研究發現，miRNA的表達與神經性疾病的發病機制密切相關[10]。如miR-9通過下調軸突指導基因軸突導向因子(NTN1)和結直腸癌缺失基因(DCC)參與周圍神經再生過程[11]；抑制miR-21可以調節Müller細胞膠質增生促進神經節細胞存活和功能的恢復[12]。然而，當前在仔豬海馬背、腹側區域中參與氧化應激反應的miRNA靶向調節機制尚不清楚，一定程度地阻礙了對氧化應激介導的神經性疾病病理機制的探索。因此，本研究基于前期投放到GEO中的氧化應激仔豬海馬背、腹側miRNA表達數據集和海馬轉錄組數據集，開展miRNA-mRNA表達關聯分析，以解析氧化應激狀態下，仔豬腦海馬中參與調控的靶標分子及相關的信號通路，為仔豬氧化應激相關的神經性疾病病理機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數據材料的來源與說明

本研究使用的數據材料來自團隊前期自身投放于基因表達數據庫(GEO)中登錄號為GSE76007、GSE76941的數據集。采用的動物為7日齡榮昌仔豬。其中，氧化應激組仔豬(4頭)在出生后的第3和4天被肌內注射右旋糖酐鐵，成功誘發了氧化應激，而對照組仔豬(4頭)在相同時間同一部位被注射相同劑量的滅菌生理鹽水。麻醉7日齡仔豬，分別采集腦組織背、腹側海馬，于液氮中速凍后，保存于-80 ℃，用于文庫的構建及測序[13]。GSE76007為采用RNA-seq技術(Hiseq 2500)獲取的對照組和氧化應激仔豬海馬轉錄組數據，含有11.5 Gb測序原始數據和經加工處理過的基因轉錄表達水平列表。GSE76941為通過RNA-seq技術(Hiseq 2500)獲取的對照組和氧化應激組仔豬背、腹側海馬的miRNA表達譜，其中，有4個讀取長度為50的對照組仔豬腦背側海馬miRNA、腹側海馬miRNA和氧化應激組仔豬腦背側海馬miRNA、腹側海馬miRNA樣品的原始數據文件以及在所有樣品中表達保守的、已知的和新的miRNA 3個加工數據。團隊前期還基于GSE76941數據集，采用Edger軟件包的qCML方法進行精確檢驗，篩選了DE miRNA。篩選的條件是miRNA的P值<0.05，并去除log2FC為NA的miRNA。并進一步采用Miranda軟件預測DE miRNAs的靶基因序列，其中，腹側海馬DE miRNAs靶向了38 805條基因序列，背側海馬DE miRNAs靶向了64 276條基因序列[13]。

1.2 數據分析方法

1.2.1 miRNA靶基因的預測和篩選 本研究基于GSE76941數據集，采用TargetScan軟件預測海馬背、腹側差異miRNA的靶基因。并基于GSE76007數據集，將DE mRNAs (P<0.05)與上述預測的靶基因進行重疊篩選，交集即為DE miRNAs潛在的靶基因。

1.2.2 DE miRNA與DE mRNA的作用關系分析 由于miRNA靶基因的表達模式通常與miRNA呈負相關，因此，為解析氧化應激狀態下，仔豬背、腹側海馬DE miRNA參與調節的靶mRNA，本研究從“1.2.1”的結果中篩選出與miRNA表達趨勢相反的mRNAs，然后根據其作用關系構建互作網絡，并使用Cytoscape[14]軟件進行可視化作圖。

1.2.3 DE miRNA靶向mRNA的GO分類和KEGG信號途徑富集分析 GO是國際標準化的基因功能分類系統，常用來描述生物體中基因和基因產物的屬性。KEGG是信號通路的主要公共數據庫，對差異表達基因的KEGG富集分析可進一步揭示參與氧化應激調節的分子機制。因此，為了評估氧化應激狀態下DE miRNA-mRNA靶基因對發揮的生物學功能和參與的信號途徑，本研究采用pathview package,Category package,org.Ss.eg.db package,GO stats package,KEGG.db package,GO.db package,RSQLite package[15-16]軟件對篩選到受DE miRNAs負調控的DE mRNAs進行GO和KEGG分析。

1.2.4 DE miRNA靶向mRNA的功能邏輯推演 為深入挖掘仔豬腦海馬背、腹側區域參與氧化應激調節的miRNA潛在靶基因，本研究基于“1.2.2”和“1.2.3”的結果，將miRNA-mRNA調控網絡、GO和KEGG功能結果進行進一步功能邏輯推演。

2 結 果

2.1 數據篩選

本研究采用的GSE76941數據集，共含有3 818個DE miRNAs。作者將預測的DE miRNAs靶基因與GSE76007數據集DE mRNA進行重疊篩選，篩選結果見表1。

表1 氧化應激狀態下仔豬海馬各部位差異表達的miRNAs和mRNAs 數量Table 1 The number of miRNAs and mRNAs differentially expressed in various parts of the hippocampus of piglets under oxidative stress

2.2 miRNA-mRNA互作網絡圖的構建

為了直觀地展示在氧化應激狀態下大鼠腦海馬組織中miRNAs和mRNAs之間的互作關系，基于“2.1”重疊篩選的結果，作者構建了miRNA-mRNA互作網絡圖(圖1～4)。其中，背側有110對上調DE miRNA-下調DE mRNA，129對上調DE miRNA-上調DE mRNA(包括15個新的miRNAs)；92對下調DE miRNA-下調DE mRNA，199對下調DE miRNA-上調DE mRNA(包括14個新的miRNAs)。腹側有93對上調DE miRNA-下調DE mRNA，146對上調DE miRNA-上調DE mRNA(包括12個新的miRNAs)；82對下調DE miRNA-下調DE mRNA，154對下調DE miRNA-上調DE mRNA(包括11個新的miRNAs)。由此可見，在負向調控的DE miRNA-DE mRNA靶基因對中，背側有309對，腹側有247對，其中，在已知的DE miRNAs靶標對中，背側有2對上調DE miRNA-下調DE mRNA，65對下調DE miRNA-上調DE mRNA；腹側有3對上調DE miRNA-下調DE mRNA，38對下調DE miRNA-上調DE mRNA(圖1、2)。

2.2.1 氧化應激狀態下仔豬腦海馬背側區域差異表達的miRNAs靶向mRNAs的關聯分析 根據miRNA-mRNA關聯分析結果，在海馬背側區域負向調節網絡互作圖中，僅有miR-452為背側上調的已知miRNAs(圖1A)；背側下調的miR-676-5p靶向上調了JAK2等基因。此外，背側下調的多個miRNAs共同靶向1個或多個基因，如下調的miR-205、miR-216同時靶向上調了DDX58等基因，下調的miR-490-5p和miR-7138-5p靶向上調了PPP3CA等基因。下調的miR-490-5p和miR-96-5p共同靶向上調了整合素亞基α3(ITGA3)，下調的miR-96-5p和miR-205共同靶向上調了金屬蛋白酶-1(MMP1)(圖1B)。

2.2.2 氧化應激狀態下，仔豬腦海馬腹側區域差異表達的miRNAs靶向mRNAs的關聯分析 在海馬腹側區域負向調節網絡互作圖中，腹側上調的miR-133a-5p靶向下調了TFRC、SCUBE1與ATP9B基因(圖2A)，腹側下調的miR-429靶向上調了RELN、DDX58等基因；腹側下調的miR-183和背側下調的miR-216均靶向上調骨膜素(POSTN)。miR-183家族成員miR-183和miR-96-5p有兩個共同的調控基因MMP1和ITGA3(圖2B)。由此可見，仔豬海馬背、腹側miRNA在氧化應激下對靶基因的調節中具有協同性和發散性。

2.3 功能與途徑富集分析

分別對篩選到的海馬背腹側靶向DE mRNAs進行的GO分類和KEGG分析，發現海馬背側靶向上調的DE mRNAs在300條GO terms中富集(P<0.05)，靶向下調的DE mRNAs在237條GO terms中富集(P<0.05)；海馬腹側靶向上調的DE mRNAs在359條GO terms 中富集(P<0.05)，靶向下調的DE mRNAs在214條GO terms中富集(P<0.05)(表2)。其中，主要功能及富集的信號通路如表2所示。

2.4 氧化應激狀態下仔豬腦海馬背、腹側區域DE miRNAs靶向DE mRNAs的功能推演

GO分類比較分析發現，在miRNA靶向上調的基因中，背、腹側有247條共同功能，主要體現在對細胞因子等刺激的反應調控方面(如miR-183/POSTN、miR-216/POSTN)(圖3A)。POSTN在膠質瘤侵襲和抗血管生成治療的抵抗中起著重要作用[17]，因此，miR-183/POSTN、miR-216/POSTN可能參與了仔豬海馬對應激的抵抗。

背側上調的靶基因特定地參與了對機械、生物刺激的反應和免疫過程等(如miR-676-5p/JAK2)(圖3A)。JAK2/STAT3通路廣泛參與細胞增殖、分化等生物學效應；抑制JAK2/STAT3通路減少了白質損傷導致的大鼠神經元的凋亡[18]，而激活JAK2能調節T細胞分化[19]，因此，miR-676-5p/JAK2可能介導了神經細胞的存活及免疫調節作用。腹側上調的靶基因則特異地參與生物合成過程等(如miR-183/IRF1) (圖3A)。在急性應激下，哺乳動物海馬中miR-183的表達顯著升高[20]。而miR-183、miR-182和miR-96-5p作為同一家族成員均可靶向神經肽基因，從而調節神經元生理活性和氧化應激等[19]。充分體現了基因調節系統中的協同性。此外，本研究發現海馬腹側下調miR-183的10個下游靶點(圖2B)。其中，IFR1可以調節多種免疫相關基因的表達[21]；MMP1是加重視神經頭部損害的危險因素[22]；ITGA3是突觸前膜上的黏附受體，調節突觸神經肌肉接頭的完整性[23]。由此推測，表達下調的miRNA-183，可以促進與神經及免疫調節有關基因的表達，從而抵抗氧化應激帶來的神經損傷。此外，腹側下調的miR-183、miR-96-5p和背側下調的miR-96-5p、miR-205的共同靶點均為MMP1，提示仔豬海馬背、腹側通過調節不同的miRNAs靶向相關基因共同參與對氧化應激相關神經性疾病的調控。

A.氧化應激狀態下，上調的miRNA負向調控的mRNA；B.氧化應激狀態下，下調的miRNA負向調控的mRNAA.Upregulated miRNA negatively regulates mRNA under oxidative stress;B.Downregulated miRNA negatively regulates mRNA under oxidative stress圖1 仔豬背側海馬miRNA靶向mRNA的局部關聯網絡Fig.1 Local association network map of miRNA-targeted mRNA in dorsal hippocampus of piglets

miRNA靶向下調的基因中，主要具有對細胞凋亡、信號傳導等方面的調控作用。其中，離子運輸、穩態調節等是背側下調靶基因的特有功能，而腹側下調的靶基因則特定地參與對細胞增殖、免疫反應、蛋白轉運等生理過程的調控(如miR-133-5p/TFRC) (圖3B)。在敲除肝素誘導的神經疾病模型中，TFRC表達增加[24]，而TFRC可以促進細胞增殖轉移[25]。因此，海馬腹側上調miR-133a-5p靶向下調TFRC可能通過減少腫瘤細胞的增殖轉移對神經疾病進行調控。

為深入挖掘仔豬海馬中參與氧化應激調節的主要靶基因，將表達最多的20條功能注釋中|log2FC|>1，P<0.05的DE mRNAs與miRNA-mRNA網絡進行匹配，發現了背側3個差異表達的靶基因(表3)。其中，MX1是一種抗病毒基因，可以抵抗豬瘟病毒等[26]；PDK4的激活可以促進小鼠肝的再生[27]；IFIT2可以抵抗小鼠肝炎病毒誘發的腦炎[28]。由此推測，miR-676-5p和miR-216很可能在氧化應激狀態下通過降低自身的表達量，誘發對抗外界刺激作用的靶基因表達，直接或間接地發揮抗病毒、抗刺激作用，從而減輕機體細胞的損傷。但它們是否參與了對海馬神經元凋亡及免疫信號通路的調節有待進一步研究。

表3 氧化應激狀態下，仔豬腦海馬背側差異極顯著的DE mRNAsTable 3 Under oxidative stress,the DE mRNAs in the dorsal hippocampus of piglets are significantly different

A.氧化應激狀態下，上調的miRNA負向調控的miRNA-mRNA；B.氧化應激狀態下，下調的miRNA負向調控的miRNA-mRNAA.Upregulated miRNA negatively regulates miRNA-mRNA under oxidative stress;B.Downregulated miRNA negatively regulates miRNA-mRNA under oxidative stress圖2 仔豬腹側海馬miRNA靶向mRNA的局部關聯網絡Fig.2 Local association network map of miRNA-targeted mRNA in ventral hippocampus of piglets

綜上可見，在氧化應激狀態下，仔豬海馬背、腹側區域均發揮了調控細胞凋亡、穩態平衡和對外界的應激反應等方面的功能，同時，也具有區域特異性反應。背側腦海馬大量miRNAs表達下降，增加了抗應激靶基因的表達，以達到抵抗外界刺激、提高生物活性、維持機體穩態的作用。而腹側腦海馬區下調的miRNAs大多增加了與神經相關疾病基因的表達，暗示其對神經性疾病的調節。

2.5 氧化應激狀態下，海馬背、腹側區域DE miRNAs靶向DE mRNAs的通路推演

本研究發現，miR-216、miR-205和miR-429靶向上調的DDX58富集于丙型肝炎感染信號通路和RIG-I樣受體信號通路；miR-7138-5p和miR-490-5p靶向上調的PPP3CA富集于鈣信號通路。有研究顯示，丙型肝炎病毒感染可引發中樞和周圍神經系統異常[29]；RIG-I樣受體信號通路的破壞，會抑制抗病毒反應，誘發神經癥狀，促進豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟的感染[30-31]；激活的鈣信號通路可預防鎘誘導的神經退行性疾病[32]。這表明在氧化應激狀態下，miR-216、miR-205和miR-429均可能靶向上調DDX58，促進RIG-I樣受體信號通路的激活；miR-7138-5p和miR-490-5p則可以上調PPP3CA，激活鈣信號通路，以此來消除由病毒等其他刺激引起的氧化應激，發揮神經保護作用。

此外，本研究還發現海馬背、腹側少量上調的miRNA靶向下調的mRNA均主要富集在ECM受體相互作用、阿米巴病等通路中。ECM受體不僅影響細胞信號傳導，還有助于維持神經突觸結構，具有介導學習和記憶能力[33]；阿米巴病信號通路則直接與中樞神經系統疾病相關[34]。因此，ECM受體相互作用和阿米巴病信號通路很可能在氧化應激誘導的腦神經疾病中起重要作用。以上分析顯示，仔豬海馬背、腹側的miRNA-mRNA對氧化應激反應表現共性調節功能的同時，也發揮了獨特的與神經系統相關的調控作用。

A.氧化應激狀態下背腹側差異表達的miRNAs靶向上調的mRNAs的GO注釋；B.氧化應激狀態下背腹側差異表達的miRNAs靶向下調的mRNAs的GO注釋。A圖左圓為背側上調的mRNAs注釋條數、A圖右圓為腹側上調的mRNAs注釋條數，B圖左圓為背側下調的mRNAs注釋條數、B圖右圓為腹側下調的mRNAs注釋條數A.GO annotation of differentially expressed miRNA targeting up-regulated mRNA in the dorsal ventral side under oxidative stress;B.GO annotation of differentially expressed miRNA targeting down-regulated mRNA in the dorsal ventral side under oxidative stress;The left circle of Fig.A is the number of up-regulated mRNA annotation bars in the dorsal side;The right circle of Fig.A is the number of up-regulated mRNA annotation bars in the ventral side;The left circle of Fig.B is the number of down-regulated mRNA annotation bars in the dorsal side;The right circle of Fig.B is the number of down-regulated mRNA annotation bars圖3 仔豬腦海馬背、腹側差異表達mRNA的GO注釋比較分析Fig.3 Comparison of GO annotation of differentially expressed mRNA in dorsal and ventral hippocampus of piglets

3 討 論

機體氧化和抗氧化系統失衡將導致氧化應激。氧化應激造成的機體損傷是動物防御機能下降和疾病發生與發展的重要因素。miRNA是新興ROS化學分子介體[35]，具有高保守性，是生物基因調控網絡中的重要組成成分。它們廣泛參與胚胎早期發育、細胞增殖分化等生理過程[36]。由此推測，miRNA 很可能通過調節靶基因參與氧化應激及抗氧化過程。

本研究通過系統開展氧化應激仔豬腦海馬背、腹側差異表達miRNA和mRNA的關聯分析，發現海馬背側7個已知miRNAs和54個基因之間存在66個互作(圖1)，腹側7個已知miRNAs和37個基因之間存在41個互作(圖2)。氧化應激導致仔豬腦海馬背、腹側區域均有大量的miRNA下調，這與前人報道的在慢性應激狀態下，大鼠海馬中表達下調的miRNA多于表達增加的miRNA[20]相似。miRNA靶向的11個基因(POSTN、JAK2、TFRC、IFR1、MMP1、ITGA3、MX1、IFIT2、PDK4、DDX58和PPP3CA)均直接或間接地參與了氧化應激或抗應激損傷的相關路徑[35,37-38]。

結合GO分類和KEGG分析進行功能推演，本研究發現，7對在氧化應激狀態下差異表達的miRNA-mRNA(海馬背側的miR-676-5p/JAK2、miR-205/MMP1和海馬腹側的miR-133a-5p/TFRC、miR-183/MMP1、miR-183/ITGA3、miR-96-5p/ITGA3及miR-96-5p/MMP1)很可能是神經性疾病調節的潛在靶點。此外，miR-452被發現在海馬背側區域上調，在腹側區域下調。下調的miR-452可以增強神經膠質瘤細胞的侵襲能力[39]；而miR-452的過表達能作用不同的靶點抑制肺癌、胰腺癌[39-40]等癌細胞的遷移和侵襲，由此提示，海馬不同區域的相同miRNA可能采用不同的表達模式參與對氧化應激的調節。與此同時，本研究發現海馬背側下調的miR-216與miR-205，miR-490-5p與miR-7138-5p，miR-490-5p與miR-96-5p，miR-96-5p與miR-205均有共同靶向上調的基因，這極大地豐富了氧化應激相關的神經性疾病的調節信息。

4 結 論

通過對氧化應激仔豬海馬背、腹側差異表達miRNA-mRNA的關聯分析，表明在氧化應激狀態下，海馬背、腹側能通過差異表達miRNAs以協同或發散的方式對mRNAs進行負向調節，并體現了海馬背、腹側參與氧化應激調節的共性與特性。GO和KEGG的分析進一步揭示miR-676-5p/JAK2、miR-205/MMP1、miR-133a-5p/TFRC、miR-183/MMP1、miR-183/ITGA3、miR-96-5p/ITGA3及miR-96-5p/MMP1可能是參與氧化應激調節的重要靶標，從而為氧化應激相關的神經性疾病臨床防控和治療提供了參考。