檢測山羊嵴病毒的實時熒光定量PCR方法的建立和應用

阿比克哈莫，余忠華，景志忠*，湯 承

(1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 農業部獸醫公共衛生重點實驗室，蘭州 730046；2.阿壩藏族羌族自治州動物科學技術研究所，紅原 624400；3.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041)

嵴病毒(kobuvirus,KoV)是小RNA病毒科一個新的屬。2019年，國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)根據KoV的Polyprotein、P1、2C和3CD區氨基酸相似性進一步將其劃分為Aichivirus A～F 6個種以及未分類的挪威鼠嵴病毒、灰松鼠嵴病毒和蝙蝠嵴病毒3個種[1]。其中，Aichivirus A成員的人愛知病毒，Aichivirus B成員的牛嵴病毒和Aichivirus C成員的豬嵴病毒為腹瀉病原[2-6]。另外Aichivirus A成員的貓嵴病毒和犬嵴病毒也與腹瀉相關[7-8]。

目前，在羊中發現了兩種不同種的KoVs：綿羊嵴病毒(ovine kobuvirus,OKoV)和山羊嵴病毒(caprine kobuvirus,CKoV)，OKoV是Aichivirus B的成員，而CKoV是Aichivirus C的成員[1]。OKoV首次在匈牙利綿羊的健康糞便樣本中檢測到[9]，隨后在巴西綿羊的健康、腹瀉糞便樣本和愛爾蘭綿羊腸系膜淋巴結中都檢測到了OKoV[7,10]。而CKoV最早是在韓國黑山羊的腹瀉糞便樣本中檢測到[11-12]，隨后又在意大利山羊的健康和腹瀉糞便樣本中檢測到[13]，2019年，ICTV將CKoV確定為Aichivirus C成員[1]。最近本實驗室在四川某地山羊腹瀉山羊糞樣本中檢測到CKoV，證實了該病毒在國內的存在，并獲得一個近似完整的基因組[14]。此外，在意大利鹿的糞樣中也檢測到CKoV[15]，表明其可能具有跨種間傳播的能力。到目前為止，國內外CKoV流行病學資料仍然匱乏，并且缺乏合適的分離CKoV的細胞培養體系，因此該病毒對山羊的致病性仍不清楚。

目前，GenBank數據庫中有3個CKoV基因組序列，包括本實驗室上傳的1個中國毒株。病毒基因組由末端結合蛋白(vpg)、5′端非編碼區(5′UTR)、1個開放閱讀框(ORF)以及3′端非編碼區(3′UTR)和聚(A)尾組成。3D基因是KoV最為保守的基因，常作為KoV的分子檢測的靶基因[16-20]。目前關于CKoV的分子檢測方法有3篇報道[11,13,21]，其中兩篇是通過最為保守的3D基因設計的KoV通用引物，通過PCR產物測序來鑒定種，其特異性和檢測效率有待于進一步評價。而特異性檢測CKoV的分子檢測方法只有1篇RT-PCR方法的報道[13]，還未見實時熒光定量PCR檢測方法的報道。盡管KoV 3D基因保守，但也存在遺傳多樣性，并表現出一定的地域特征[22]。目前，GenBank中CKoV 3D基因序列信息不多，只有3個完整的CKoV 3D基因和11個國外毒株的CKoV 3D基因片段。3個完整的CKoV 3D基因核苷酸之間的相似性為92.5%～94.4%，而11個CKoV 3D基因片段核苷酸之間的相似性為68.5%～98.4%，表明CKoV 3D基因存在遺傳多樣性。本試驗的目的是建立基于3D基因特異性檢測CKoV的實時熒光定量PCR方法，并調查CKoV在國內的流行情況。

1 材料與方法

1.1 羊常見病原核酸和臨床樣本

A群羊輪狀病毒(ovine rotavirus，ORoV)、羊腸道病毒(caprine enterovirus,CEoV)、羊星狀病毒(caprine astrovirus，CAoV)、牛星狀病毒(bovine astrovirus,BAoV)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、山羊源產腸毒素大腸桿菌ETEC K99、山羊源沙門菌(Salmonella) CVCC528、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis) CVCC3847、山羊源志賀菌(Shigella) CVCC1881菌株、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、糞腸球菌(Enterococcusfaecium)的核酸樣本，均由西南民族大學動物醫學實驗室保存并提供。

24份山羊(3月齡以內)腹瀉糞樣本，于2019年1—12月采自四川成都3個山羊養殖場，用于比較檢測方法，由西南民族大學動物醫學實驗室保存。79份山羊(3月齡以內)腹瀉糞樣本，于2020年1—4月分別采自西南地區3個省市山羊養殖場，其中四川7個場39份、重慶6個場35份、云南2個場5份，用于流行病學調查。所有樣本于-80 ℃保存備用。

1.2 主要試劑及儀器

QuickTaqHS DyeMix購自TOYOBO東洋紡生物科技有限公司；Prime ScriptTMRT試劑盒為大連寶生物工程有限公司產品；pMD19-T載體、DH5α感受態細胞、DNA Marker Ⅰ、Tirzol試劑盒(RNAiso Plus)、TB Green Premix ExTaqⅡ等購自TaKaRa公司；核酸染料GoldenView購自西安赫特生物；Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、Plasmid Mini kit質粒小量提取提取試劑盒均為OMEGA公司產品。Doc2000凝膠成像系統為美國Bio-Rad公司產品；熒光定量PCR儀為中國BIOER產品)；Cary50Probe紫外分光光度計為美國Vatian公司產品；TGL-16高速冷凍離心機為中國蜀科公司產品。

1.3 引物設計與合成

查詢并下載GenBank收錄的CKoV 3D基因序列，共計11個部分3D基因和3個完整的3D基因。利用 MEGA10.0軟件分析比對3D基因，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)，本研究預期目的片段為176 bp，位于6 874—7 049 nt(GenBank收錄號MT584793)。由上海生工生物工程有限公司負責相關引物合成。

表1 4種RT-PCR方法的引物信息Table 1 Primers informations for four kinds of RT-PCR assays

1.4 樣品處理及核酸提取

按糞便樣品∶滅菌PBS(pH 7.2)體積比1∶5制備糞懸液。糞懸液于-80 ℃反復凍融3次，8 000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清，經0.22 μm一次性濾器過濾后再取上清300 μL，用TrizolTMReagent試劑盒提取樣本總RNA[23]。提取的RNA用Prime ScriptTMRT試劑盒反轉錄成cDNA，酚-氯仿法提取DNA[23]，-20 ℃保存備用。

1.5 陽性標準品的制備

以CKoV SWUN/F11/2019毒株的cDNA為模板，用自行設計的特異性引物CKoV F/R(表1)進行RT-PCR擴增。采用25 μL反應體系：CKoV F和CKoV R各1.0 μL，模板1.5 μL，EmeraldAmp PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O補足至25 μL。反應條件同文獻[23]“陽性標準品的制備”。反應結束后，3.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物。鑒定正確后，膠回收擴增產物并連接至pMD19-T，后續操作同文獻[23]。最后提取重組質粒，送生工生物有限公司測序，以測序結果正確的重組質粒作為陽性標準品。用紫外分光光度計檢測上述陽性標準品的濃度，并按照以下公式換算為拷貝數，拷貝數(copies·μL-1)=(6.02×1023copies·mol-1)×(濃度 μg·mL-1)×10-9/(分子質量 g·mol-1)。

1.6 反應體系及條件的優化

1.6.1 退火溫度的優化 采用20 μL體系：CKoV陽性標準品1.5 μL，TB Green Premix ExTaqII 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,dd H2O至20 μL。優化判斷標準以最小Ct值、最大產物熒光值、特異性單峰等作為指標，選擇50～60 ℃對退火溫度進行10個梯度的優化。

1.6.2 引物用量的優化 采用“1.6.1”的反應體系以及最佳退火溫度，選擇0.5～1.5 μL間的8個梯度對引物(濃度為10 mol·L-1)的用量進行優化。

條件優化后即建立基于TB Green的檢測CKoV核酸的實時熒光定量PCR方法。

1.7 熔解曲線分析和標準曲線的建立

10倍遞增稀釋CKoV陽性標準品。用“1.6”建立的實時熒光定量PCR方法分別對10-1～10-10遞增稀釋的標準品進行檢測，同文獻[23]方法制作標準曲線，并按照以下公式計算出擴增效率，擴增效率(E)=10-1/斜率-1。

1.8 實時熒光定量PCR方法的評價

1.8.1 特異性評價 用建立的實時熒光定量PCR方法對常見羊病病原的核酸樣本進行檢測，以RNase Free ddH2O作為陰性對照。

1.8.2 穩定性評價 分別取等量的2.23×104、2.23×105和2.23×106copies·μL-1的重組質粒，按上述方法進行實時熒光定量PCR擴增，每份樣品設3個重復，進行批內重復性試驗；同取以上3份樣品，在相同反應條件下進行3次獨立的檢測，進行批間重復性試驗。

1.8.3 敏感性測定 以101～1010稀釋度的標準品為模板，以RNase Free ddH2O為陰性對照，按上述方法進行實時熒光定量PCR擴增，每個濃度設3個重復。

1.8.4 4種方法的比較 采用所建立的實時熒光定量PCR方法和常用于檢測KoV的3種RT-PCR方法[11，13，21]分別平行對24份山羊腹瀉糞樣本進行檢測，比較其檢出率，引物信息見表1，全部的陽性PCR產物送生工生物有限公司測序。

1.9 臨床樣本中CKoV的檢測

利用本試驗建立的實時熒光定量PCR方法對79份山羊腹瀉糞樣本進行CKoV的檢測，從陽性樣本中隨機挑選20%進行測序，以驗證檢測結果的正確性。

1.10 CKoV完整的3D基因序列擴增及分析

自行設計2對引物分段擴增完整的3D基因，引物序列如下，F1:5′-CGTTGTCGGCTCTTCTGGCTTCT-3′,R1:5′- CTATGCGAAAAGCACA- GGAGGGA-3′;(6 500—7 329 nt,GenBank收錄號：MT584793);F2′:5′-GTGACGGCGGGAC-TTACCAGAG-3′;R2:5′- GGGTGAAACGCCTGGGAAGAG-3′ (7 083—8 078 nt,GenBank收錄號：MT584793)，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。分段擴增CKoV陽性樣本3D基因，擴增的目的片段經膠回收，連接至pMD19-T載體后，轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，提取質粒送往上海生工生物有限公司測序。

使用SeqMan software軟件拼接3D基因序列，使用DNASTAR7.0軟件中的MEGAlign程序測定核苷酸序列和推斷氨基酸序列的相似性，使用MEGA 7.0軟件以Neighbor-Join法(Bootstrap值為1 000)構建系統進化樹。

2 結 果

2.1 引物的特異性驗證

用自行設計的特異性引物從SWUN/F11/2019毒株cDNA中擴增出預期大小的目的片段(圖1)，測序結果證明目的片段長度為176 bp，符合預期結果，與GenBank中CKoV 3D基因的相似性為100%，為CKoV 3D基因的特異序列。

M.DNA相對分子質量標準;-.陰性對照；+.陽性樣品M.Gene ruler ultra-low range DNA ladder;-.Negative control；+.CKoV positive sample圖1 引物擴增片段電泳鑒定Fig.1 Gel electrophoresis of amplification fragment by specific primers

2.2 優化的實時熒光定量PCR反應體系及條件

優化后的20 μL反應體系：上、下游引物各0.5 μL，模板1.5 μL，TB Green Premix ExTaqⅡ 10 μL，ddH2O補至20 μL。

優化后的反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s，40個循環；熔解段95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s，循環1次，反應結束。

2.3 標準曲線及熔解曲線

紫外分光光度計測得陽性標準品的濃度為70 ng·μL-1，換算后相應拷貝數為2.23×1010copies·μL-1。按照優化后的反應條件進行反應，本試驗建立的方法在陽性模板濃度為2.23×102～2.23×108copies·μL-1之間呈現良好的線性關系(圖2 A)，標準曲線為y=-3.110 6x+ 38.09，相關系數R2值為0.999 2，擴增效率為110%。結果說明該方法線性關系良好、擴增效率好。熔解曲線結果(圖2 B)顯示，PCR產物在87 ℃左右均出現單一波峰，無引物二聚體和非特異擴增峰。用本試驗設計的檢測引物對同一模板的3次重復檢測結果一致，證明該方法有良好的重復性(結果未展示)。

圖2 CKoV real-time PCR檢測方法的標準曲線(A)及熔解曲線(B)Fig.2 Standard curve (A) and melting curve (B) of real-time PCR for CKoV

2.4 方法的特異性

本試驗建立的實時熒光定量PCR方法僅對CKoV具有良好的擴增曲線，不擴增其他無關病原(圖3)。

1.CKoV標準品模板；2～13.ORoV、CEoV、CAoV、BAoV、BVDV、BCoV、ETEC K99、山羊源沙門菌、奇異變形桿菌、山羊源志賀菌、枯草芽胞桿菌、糞腸球菌；N.陰性對照1.CKoV positive samples;2-13.ORoV,CEoV,CAoV,BAoV,BVDV,BCoV,ETEC K99,Salmonella,Proteus mirabilis,Shigella,Bacillus subtilis,Enterococcus faecium;N.Negative control圖3 實時熒光定量PCR的特異性Fig.3 The specificity test of the real time fluorescent quantitative PCR

2.5 方法的穩定性

本次所建立的實時熒光定量PCR方法批內變異系數CV為0.56%～0.87%，批間變異系數為0.43%～0.86%(表2)，表明該方法的檢測穩定性良好。

表2 實時熒光定量PCR方法的穩定性(n=3)Table 2 Stable test of real time fluorescent quantitative PCR (n=3)

2.6 方法的敏感性

將2.23×1010copies·μL-1標準陽性質粒作10倍遞增稀釋，以101～1010稀釋度的標準品為模板進行實時熒光定量PCR檢測，同時以等量RNase Free ddH2O代替模板作為陰性對照。結果顯示，101～109稀釋度范圍內均具有特異性擴增曲線，該方法所能檢出的最低拷貝數為22.3 copies·μL-1(圖4)。

1～10.2.23×109～2.23×100；N.陰性對照1-10.2.23×109～2.23×100；N.Negative control圖4 實時熒光定量PCR的敏感性Fig.4 The sensitivity test of the real time fluorescent quantitative PCR

2.7 四種檢測方法的比較

4種檢測方法對24份山羊腹瀉糞樣本中CKoV的檢測結果見表1，本試驗所建方法的檢出率明顯高于文獻里其他3種方法(P<0.05)，且作者建立方法檢出的陽性樣本包括了其他3種方法所檢出的所有陽性樣本。本方法檢出的全部陽性樣本的PCR產物經測序證實均為CKoV的目的基因片段。

2.8 山羊腹瀉糞樣本中CKoV的檢出率

對79份山羊腹瀉糞樣本的檢測結果顯示，CKoV平均陽性率為25.3%，平均場陽性率53.3%。四川山羊糞樣本中CKoV的檢出率為30.84%，場陽性率為57.1%；重慶山羊糞樣本中CKoV的檢出率為8.6%，場陽性率為33.3%；云南山羊糞樣本中CKoV的檢出率為100%，場陽性率為100%。隨機挑選的20%陽性PCR產物經測序證實均為目的片段，進一步證明該方法檢測結果的準確性。

2.9 CKoV 3D完整基因的克隆

從四川和云南共5個山羊養殖場的CKoV陽性糞樣本中成功克隆出大小為1 404 bp的13個完整的3D基因，編碼468個氨基酸(GenBank登錄號:MW187484～MW187496)。這13個3D基因間的核苷酸相似性為99.6%～100%，氨基酸相似性為99.6%～100%，與GenBank中的僅有的3個 CKoV完整的3D基因核苷酸相似性為92.3%～100%，氨基酸相似性為98.5%～100%，與GenBank中11個CKoV 3D基因片段的相似性為70.1～92.9%，氨基酸相似性為83.6～98.4%。

系統發育分析表明，這13株CKoV 3D基因與GenBank中唯一的中國CKoV毒株的3D基因共同聚為單獨的一個大支(圖5)，表明了國內CKoV 3D基因具有獨特的進化趨勢。與GenBank中另外2個CKoV完整的3D基因序列相比，14個中國毒株的完整3D基因序列有59個共同的核苷酸突變，其中9個為有義突變，導致了3個氨基酸的突變(E43G、D252E和T368S)。

●.本研究毒株；▲.本實驗室前期克隆的1個中國毒株● marks the strain in this study,▲ marks the Chinese strain previously cloned in our laboratory圖5 CKoV完整3D基因的鄰近法演化樹Fig.5 Neighbor-joining consensus tree for CKoV complete 3D gene

3 討 論

KoV是人和多種動物的腹瀉病原[2,4-5,18-19]，常用的KoV檢測方法的靶基因均為3D基因[8,24-26]。盡管3D基因在KoV成員中相對保守，但也存在遺傳多樣性，并表現出一定的地域特征[22,24]。研究表明KoV 3D基因核苷酸的平均替換率為2.64×102替換·(位點·年)-1[27]。目前檢測CKoV的方法有3篇文獻報道[11,13,21]。Melegari等[13]以3D基因為靶基因的特異性檢測CKoV的RT-PCR方法，該RT-PCR方法的上游引物(21個堿基)擴增位點在國內唯一上傳的1個完整CKoV 3D基因序列的第4位發生突變(T→C)，而下游引物(22個堿基)擴增位點在第2、5、17位發生突變(C→T，G→C，C→T)，這些堿基突變很可能會影響擴增效率。Lee等[11]以人愛知病毒毒株AiV-1和牛嵴病毒毒株U-1 共保守的3D基因設計引物的RT-PCR方法，Reuter等[21]以人愛知病毒毒株AiV-1和牛嵴病毒毒株U-1以及豬嵴病毒S-1-HUN共保守的3D基因設計引物的RT-PCR方法，這兩種方法通用引物的擴增位點均與我國毒株不完全匹配，并且均需PCR測序來鑒定種，其特異性也需要進一步驗證。本研究根據CKoV流行毒株的3D基因建立了實時熒光定量PCR方法，具有良好的特異性、靈敏性和穩定性，與國外上述3種檢測CKoV的RT-PCR方法相比，極大地提高了臨床樣本中CKoV的檢出率，為CKoV的檢測和流行病學調查提供了新的技術手段。

CKoV作為山羊新發病毒，其流行病學資料仍然匱乏。本試驗用建立的實時熒光定量PCR方法對2020年1—4月四川、云南和重慶共15個山羊養殖場的79份山羊腹瀉糞樣本進行了檢測，山羊CKoV的檢出率為25.31%，場陽性率為53.3%，證明該病毒已在上述地區山羊中廣泛流行。由于臨床樣本均來自于山羊腹瀉糞樣本，未采集山羊健康糞樣本作對照，所以CKoV與腹瀉之間的關系還需要進一步調查。盡管CKoV的致病性不清楚，但多種KoVs，如人愛知病毒、牛嵴病毒和豬嵴病毒等是導致動物腹瀉的重要病原，因此有必要擴大樣本進一步調查CKoV在國內的流行情況以及與山羊腹瀉間的聯系。

目前，GenBank中有3個完整的3D基因，包括本實驗室前期上傳的1個中國毒株。本研究成功獲得了13個國內流行毒株完整的3D基因序列，為CKoV的檢測方法的建立和遺傳進化分析提供了基礎數據。進化分析已有的14個中國毒株完整3D基因的序列，發現這些毒株共同聚為單獨的一個大支，與國外毒株具有顯著的遺傳距離，說明中國毒株具有獨特的進化趨勢(圖5)，這可能與地域、環境和自然選擇模式等壓力有關[22,27]。3D基因編碼區含有高度保守的氨基酸序列KDELR、YGDD 和FLKR，作為病毒依賴RNA的聚合酶在KoV增殖中起關鍵作用[28]。14個中國株的完整3D基因編碼的氨基酸序列與GenBank中另外2個國外3D氨基酸序列相比，有3個共同的氨基酸突變，但它不在RNA的聚合酶區域，這種獨特的氨基酸突變是否會影響3D基因的分子功能需要進一步研究。

4 結 論

作者基于3D基因成功建立了特異性檢測CKoV的實時熒光定量PCR方法，特異性和重復性好，靈敏性高，為CKoV的檢測和流行病學調查提供了新的技術手段。并且，CKoV已在四川、云南和重慶3省腹瀉山羊中廣泛流行，其3D基因具有獨特的進化趨勢。