青蒿琥酯聯合胰島素對1型糖尿病合并牙周炎大鼠股骨改建的影響及機制

周婧婧，農曉琳

廣西醫科大學附屬口腔醫院，南寧530021

糖尿病性骨質疏松癥（DOP）是糖尿病常見的并發癥，是由胰島素分泌相對或者絕對不足導致的全身代謝性疾病，表現為骨量減少、骨組織微觀結構破壞、骨密度降低及骨脆性增加。研究認為，骨保護素（OPG）/核因子κB受體活化因子配體（RANKL）/核因子κB受體活化因子（RANK）信號通路是參與骨改建的重要途徑，是介導骨平衡的重要環節［1-2］。慢性牙周炎是糖尿病的并發癥之一，其導致的炎癥反應釋放白細胞介素1β（IL-1β）等炎性因子進入全身血液系統，干擾正常的免疫功能，作用于遠端股骨，進一步加快DOP的疾病進程［3-4］。青蒿琥酯（ART）是青蒿素的衍生物之一。研究顯示，ART可通過抑制破骨細胞的生成預防骨質疏松［5］。而胰島素及其下游信號通路也可以通過介導成骨細胞和破骨細胞的發育影響骨改建過程［6］。目前關于ART聯合胰島素干預1型糖尿病合并牙周炎的作用效果及其分子機制尚不明確。2020年5月—2020年10月，我們對1型糖尿病合并牙周炎大鼠給予ART聯合胰島素干預，觀察其對股骨骨密度、組織形態學結構及IL-1β、OPG蛋白表達的影響，旨在為臨床治療DOP提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年雄性SD大鼠40只，6周齡，體質量（180±20）g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。符合國家實驗室動物倫理保護標準及相關法律規定，按照3R原則給予實驗動物人道的關懷照顧。將大鼠飼養于SPF清潔級實驗室，相對濕度40%～70%，溫度18～25℃，12 h/12 h光暗循環。室內通風良好，大鼠自主進食標準飼料、正常飲水。適應性喂養1周用于實驗。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 ART注射液（廣西桂林南藥有限公司），重組人胰島素（北京索萊寶科技有限公司），鏈脲佐菌素（STZ，廣州賽國科技有限公司）。牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis，廣東省微生物菌種保藏中心），胰蛋白酶試劑（福州邁新生物技術開發有限公司），兔抗鼠IL-1β、OPG多克隆抗體及生物素化山羊抗兔IgG（美國Bioworld公司）。血糖儀（德國羅氏活力型快速血糖儀），LCT-200 micro-CT（日本Aloka公司），Eclipse Ni-E正置熒光顯微鏡（日本Nicon公司）。

1.2 動物分組與模型制備 將大鼠隨機分為模型組32只與正常對照組8只。模型組參照葉桐江等［7］的方法建立1型糖尿病模型，大鼠禁食20 h后左下腹腔一次性注射1%STZ注射液50 mg/kg，以注射后3 d及7 d隨機血糖均≥16.7 mmol/L或空腹血糖≥10 mmol/L為造模成功。造模成功后，參照趙戩等［8］的方法建立牙周炎模型。將胰蛋白胨大豆肉湯粉和酵母提取物加入雙蒸水充分溶解，再加入氯化血紅素和維生素K1，配制成牙齦卟啉單胞菌厭氧液體培養液。取牙齦卟啉單胞菌，接種于TSA+5%脫纖維羊血的血瓊脂平板上，4℃、厭氧環境下保存。使用前將菌株接種至厭氧培養液中，厭氧搖床上搖勻12 h，制成牙齦卟啉單胞菌懸液。以直徑0.2 mm的正畸結扎絲于雙側上頜第一磨牙牙頸部環形結扎，使用1 mL注射器將牙齦卟啉單胞菌液注射在頰側及腭側齦溝底部，每次0.1 mL，每3天注射1次，連續4周。造模成功標準：結扎絲在位無脫落并出現明顯的牙齦紅腫，探診深度增加，出現較深的牙周袋，探診易出血。將造模成功的32只大鼠隨機分為模型對照組、ART干預組、INS干預組、ART+INS干預組，每組各8只。正常對照組一次性腹腔注射等量檸檬酸—檸檬酸鈉注射液，后續牙齒無處理。

1.3 藥物干預 ART干預組給予ART注射液50 mg/kg灌胃，INS干預組給予重組人胰島素注射液6 U/kg腹腔注射，ART+INS干預組給予50 mg/kg ART注射液灌胃及6 U/kg重組人胰島素注射液腹腔注射，正常對照組及模型對照組使用等量生理鹽水灌胃、注射，每天1次，連續4周。

1.4 標本采集與處理 干預4周后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死。逐層剝離雙側股骨，取左側股骨用生理鹽水浸潤的濕紗布及錫箔紙包裹，放入液氮中保存，用于檢測BMD；右側股骨加入4%多聚甲醛溶液固定24 h，加入15%EDTA脫鈣液中脫鈣28 d，待大頭針可無阻力刺入股骨組織即表示脫鈣過程完成。加入梯度乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機切5μm厚切片，用于后期HE染色和免疫組化染色。

1.5 股骨平均骨密度（BMD）檢測 取大鼠左側股骨，加入4%多聚甲醛固定24 h，將近心端修剪成長度1.5 cm左右，按照股骨的長軸方向放置并固定，使用micro-CT掃描重建。掃描電壓為低電壓，像素大小為24μm，掃描層厚為24μm，360°環形掃描。將掃描得到的數據導入micro-CT自帶的分析軟件中進行等分割解析，計算BMD。

1.6 骨組織形態學觀察 取股骨石蠟切片，常規HE染色，中性樹膠封片。正置熒光顯微鏡下觀察組織形態學表現并拍照。

1.7 骨組織IL-1β、OPG蛋白表達檢測 采用免疫組化染色法。石蠟切片脫蠟，加入0.1%胰蛋白酶消化液，37℃消化10 min。PBS沖洗，分別加入一抗兔抗鼠IL-1β（1∶200）和OPG（1∶200），4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，滴加二抗生物素化山羊抗兔IgG（1∶200），室溫孵育30 min。PBS沖洗3次，滴加DAB顯色劑，蘇木素復染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封片。正置熒光顯微鏡下觀察并采集照片，胞質為黃色或棕黃色為陽性。隨機選取5個視野，采用Image-Pro Plus6.0圖像軟件進行分析，染色結果表示為平均光密度值（MOD）。

1.8 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組股骨BMD比較 正常對照組、模型對照組、ART干預組、INS干預組、ART+INS干預組股骨BMD分別為（248.02±29.66）、（155.24±26.51）、（189.43±20.78）、（192.67±25.98）、（211.01±24.13）mg/cm3。與正常對照組相比，模型對照組、ART干預組、INS干預組、ART+INS干預組股骨BMD均下降（P均<0.05）；與模型對照組比較，ART干預組、INS干預組、ART+INS干預組股骨BMD均升高（P均<0.05），其中ART+INS組高于其他兩個干預組（P均<0.05）。

2.2 各組骨組織形態學比較 與正常對照組相比，模型對照組表現為骨小梁數量明顯減少，排列不規律，粗細不均勻，連續性破壞，部分區域出現空腔，鏡下有大量的破骨細胞，胞質嗜堿性，含有多個緊密堆積的核。與模型對照組比較，ART干預組、INS干預組及ART+INS干預組中可見骨小梁排列方向、厚度及數量有改善，新生骨小梁增多，空腔范圍縮小，破骨細胞數量減少，可見骨小梁表面附著有扁平狀、核深染的成骨細胞。其中，ART+INS干預組成骨改變較其他兩個干預組更明顯，骨小梁數量顯著增多，排列較為規律，厚度增加，連續性較好。

2.3 各組骨組織IL-1β、OPG蛋白表達比較 IL-1β表達于細胞質中，陽性呈棕色或棕黃色顆粒，巨噬細胞、單核細胞等均可見。OPG表達于成骨細胞、單核細胞等的胞質中，陽性表達也為黃色或棕黃色顆粒。與正常對照組相比，模型對照組，ART干預組，INS干預組及ART+INS干預組IL-1β蛋白表達升高、OPG蛋白表達下降（P<0.05），但ART干預組、INS干預組、ART+INS干預組IL-1β蛋白表達量均低于模型對照組（P均<0.05），OPG表達量均高于模型對照組（P均<0.05），其中ART+INS干預組較模型對照組差異最為顯著（P<0.05）。見表1。

表1 各組股骨組織IL-1β、OPG蛋白表達比較（±s）

表1 各組股骨組織IL-1β、OPG蛋白表達比較（±s）

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05。

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3 討論

DOP表現為成骨細胞數量減少，抑制正常的類骨質形成，骨礦化速度減慢，破骨細胞數量增加，導致相對穩定的骨改建平衡被打破，骨形成慢于骨吸收。其在股骨中表現為骨生物力學性能下降，骨脆性增加，易發生病理性骨折［11］。牙周病是口腔慢性疾病，當其合并糖尿病時，高血糖促使牙周免疫力下降，出現小血管變性，降低單核細胞正常的趨化、黏附及吞噬功能，進一步加重牙周組織的破壞；聚集在牙周支持組織的細菌及細菌產物可導致炎癥分子合成增加，并大量分泌到血液中，加重骨吸收，最終表現為DOP的臨床癥狀［12-13］。目前臨床上治療DOP主要從控制血糖、減少或緩解并發癥（如門冬胰島素）與抑制骨吸收、促進骨形成（如降鈣素、阿侖膦酸鈉）兩個方面入手，其治療效果仍有一定的局限性。胰島素信號參與調節成骨細胞的骨形成過程和破骨細胞的骨吸收過程，通過結合兩種細胞表面的胰島素受體，介導其增殖與分化［21］。ART是青蒿素的衍生物，具有抗腫瘤、抗炎癥、抗纖維化等作用［22］。WEI等［23］報道，ART可抑制RANKL誘導的破骨細胞生成，預防骨丟失。本研究采用ART聯合胰島素干預1型糖尿病合并牙周炎大鼠，觀察其對大鼠骨密度、遠端股骨骨質結構及IL-1β、OPG蛋白表達的影響，探討其對DOP的預防和治療作用。

IL-1β是已知最高效的骨吸收刺激因素，主要由成骨細胞及單核巨噬細胞分泌，通過活化OPG/RANKL/RANK通路，介導破骨細胞分化，促進破骨細胞增殖，在牙周結締組織降解及牙槽骨吸收過程中發揮重要作用［14-15］。OPG在骨組織中大部分由成骨細胞和骨基質細胞分泌而來，競爭性地與RANKL結合，通過OPG/RANKL/RANK系統發揮作用，阻斷RANK結合RANKL，作用于破骨細胞分化終末階段促進破骨細胞凋亡，抑制破骨細胞正常的分化、融合和成熟，維持骨代謝平衡；其表達減少時會出現明顯的骨質疏松［16］。LI等［24］研究顯示，下調IL-1β等炎性介質的合成分泌，可以抑制RANKL誘導的破骨細胞形成，減弱骨質吸收。El-BAZ等［25］研究表明，雨生紅球藻可以通過上調血清RANKL、下調血清OPG含量來改善骨質疏松大鼠的骨丟失。本研究結果顯示，模型對照組較正常對照組骨密度下降，股骨骨質結構出現明顯破壞，骨小梁數量減少，股骨組織中IL-1β蛋白表達升高、OPG蛋白表達下降。提示1型糖尿病合并牙周炎可能通過介導OPG/RANKL/RANK通路增加了遠端股骨的破骨細胞活性，加重骨吸收，破壞骨平衡。給予ART、INS、ART聯合INS干預后，各組骨密度均增高，骨質顯著改善，骨小梁數量及厚度增加，排列更加規律，空隙減少，成骨細胞多見，骨形成大于骨吸收；IL-1β蛋白表達下降、OPG蛋白表達升高，且ART聯合INS組改善最為顯著。分析其作用機制可能為ART聯合胰島素通過下調1型糖尿病合并牙周炎大鼠骨組織中的IL-1β、上調OPG表達，介導OPG/RANKL/RANK通路，阻斷破骨細胞的分化和成熟，延緩了骨吸收進程，達到改善糖代謝、促進骨再生、增強骨結構的效能。

綜上所述，ART聯合胰島素能夠增加1型糖尿病合并牙周炎大鼠的骨密度，改善骨小梁微結構；其機制可能是通過調控IL-1β、OPG表達，介導OPG/RANKL/RANK通路，改善糖代謝，抑制骨吸收，促進骨礦化，從而發揮防治骨質疏松的作用。本研究為防治DOP提供了新思路。