三種新型冠狀病毒抗體檢測系統(tǒng)一致性評價(jià)

張華，耿亞松，王倩，付東鶴，唐洪影，楊玲，董莉真，吳高鵬，李桂柃，李天寧，袁玉華

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院空港醫(yī)院，天津300308

2019年12月以來，全球各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不明原因引起的肺炎病例，通過對患者呼吸道標(biāo)本病毒全基因組測序、核酸檢測等多種方法證實(shí)，該病毒是一種從未在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的β屬冠狀病毒新毒株［1］，WHO將其命名為新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）。目前全球累計(jì)新型冠狀病毒肺炎確診病例超過1億例，死亡人數(shù)逼近300萬，已經(jīng)發(fā)展為全球性公共安全衛(wèi)生事件［2］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR核酸檢測是診斷SARS-CoV-2感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在一定的局限性［3］，臨床中可能出現(xiàn)影像學(xué)診斷、臨床表現(xiàn)與核酸檢測結(jié)果不相符的現(xiàn)象［4］。同時(shí)核酸檢測存在方法學(xué)局限性，目前無法進(jìn)行定量檢測，不能對病情發(fā)展進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。血液樣本易獲取、穩(wěn)定、可定量檢測，因此血清IgM/IgG抗體檢測可彌補(bǔ)核酸檢測的不足，避免因采樣原因造成的假陰性，可與核酸聯(lián)合檢測用于疑似患者的確診［5-6］。目前對于SARSCoV-2抗體血清學(xué)的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確。龍泉鑫等［7］分析了新型冠狀病毒感染機(jī)體后抗體的變化規(guī)律，在癥狀發(fā)作后19 d內(nèi)，所有患者特異性IgG抗體檢測均呈陽性，表明抗體檢測對疾病的診斷和監(jiān)測具有重要意義。為進(jìn)一步落實(shí)對病例的早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告、早隔離、早治療的防控政策，全國將進(jìn)行重點(diǎn)人群核酸檢測、抗體檢測，因此抗體檢測系統(tǒng)的能力與質(zhì)量尤為重要。我們收集了本院2020年3～4月的SARS-CoV-2抗體檢測數(shù)據(jù)，對三種化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)IgM/IgG檢測結(jié)果進(jìn)行一致性評價(jià)，將定性結(jié)果與臨床診斷結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，探討新型冠狀病毒IgM/IgG抗體檢測的臨床價(jià)值，為新型冠狀病毒感染的診斷與預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院空港醫(yī)院收治的入境篩查者的血清樣本。其中SARSCoV-2核酸檢測陽性23例，符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案（第七版）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］，確診為SARSCoV-2感染；核酸檢測陰性23例，來自同期健康人群，均無臨床癥狀，無其他基礎(chǔ)疾病。

1.1.2 儀器與試劑 重慶博奧塞斯Axceed260化學(xué)發(fā)光測定儀及其配套試劑（IgM批號G202004313，IgG批號G202004313），深圳亞輝龍iModules化學(xué)發(fā)光測定儀及其配套試劑（IgM批號20200202，IgG批號20200202），天津丹娜生物Smart 500S化學(xué)發(fā)光測定儀及其配套試劑（IgM批號20200401，IgG批號20200401）。

1.2 檢測方法 采集受試者靜脈血3 mL，置于含分離膠的真空采血管，3 500 r/min離心10 min，56℃水浴箱中滅活30 min。將上述3個(gè)化學(xué)發(fā)光測定系統(tǒng)（包括儀器與其配套試劑）隨機(jī)編號為A、B、C，使用3個(gè)系統(tǒng)分別對46份樣本進(jìn)行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測，嚴(yán)格按照儀器和試劑說明書操作。根據(jù)樣本的S/CO值進(jìn)行結(jié)果判斷，S/CO值=樣本發(fā)光值/cut-off值。S/CO值<1.0判定為陰性，≥1.0判定為陽性。

1.3 精密度驗(yàn)證 采用各檢測系統(tǒng)廠家提供的配套SARS-CoV-2質(zhì)控品進(jìn)行精密度驗(yàn)證。參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）EP15-A3方案，使用A、B、C系統(tǒng)分別檢測高、低水平的質(zhì)控品，每天5次，連續(xù)5天，計(jì)算各水平的批間精密度，并與試劑說明書中廠家聲明的產(chǎn)品性能指標(biāo)進(jìn)行對照。

1.4 方法學(xué)比對 參考CLSI EP9-A3方案［9-10］，用Medcalc18.0軟件對A、B、C 3個(gè)系統(tǒng)SARS-CoV-2 IgG、IgM檢測結(jié)果進(jìn)行離群值檢驗(yàn)，使用passingbablok回歸模型對3個(gè)檢測系統(tǒng)結(jié)果兩兩比較（AvsB、AvsC、BvsC），顯示回歸方程y=a+bx，并計(jì)算各組合的相關(guān)系數(shù)（r）、截距、斜率及95%C I；將3個(gè)系統(tǒng)檢測IgG、IgM定性結(jié)果分別與鼻/咽拭子核酸檢測結(jié)果進(jìn)行比對，采用χ2檢驗(yàn)對定性結(jié)果與臨床最終診斷結(jié)果進(jìn)行差異性分析，以（真陰性+真陽性）/總例數(shù)計(jì)算抗體檢測結(jié)果與核酸檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 三種系統(tǒng)抗體檢測精密度驗(yàn)證結(jié)果 A、B、C系統(tǒng)檢測IgG抗體的精密度分別為4.59%～5.08%、4.40%～4.91%、4.25%～8.09%，符合廠家聲明的檢測結(jié)果變異系數(shù)<15%、<10%、<15%；檢測IgM抗體精密度分別為4.92%～5.39%、3.97%～4.19%、4.18%～8.44%，符合廠家聲明的檢測結(jié)果變異系數(shù)<15%、<10%、<15%。

2.2 抗體定量檢測比對結(jié)果

2.2.1 IgG抗體定量檢測比對結(jié)果 對三種系統(tǒng)IgG抗體的檢測結(jié)果進(jìn)行passing-bablok回歸分析，回歸方程分別為AvsB：y=0.0253+0.173x、AvsC：y=0.0172+0.0338x、BvsC：y=0.194+0.761x，兩兩比對，A系統(tǒng)與B系統(tǒng)的相關(guān)性最佳（r=0.871，P<0.05）。見表1。

表1 三種系統(tǒng)檢測IgG抗體的passing-bablok回歸分析結(jié)果

2.2.2 IgM抗體定量檢測比對結(jié)果 對三種系統(tǒng)IgM抗體結(jié)果進(jìn)行passing-bablok回歸分析，回歸方程 分 別 為AvsB：y=0.025 3+0.194x、AvsC：y=0.006 9+0.098 5x、BvsC：y=0.091 9+0.44x。兩兩比對，A系統(tǒng)與C系統(tǒng)的相關(guān)性最佳（r=0.885，P<0.05）。見表2。

表2 三種系統(tǒng)檢測IgM抗體的passing-bablok回歸分析結(jié)果

2.3 抗體定性檢測比對結(jié)果

2.3.1 IgG抗體定性檢測比對結(jié)果 三種系統(tǒng)IgG抗體定性檢測結(jié)果與核酸檢測結(jié)果符合率為91.3%～95.6%，三種系統(tǒng)與核酸檢測結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。見表3。

2.3.2 IgM抗體定性檢測比對結(jié)果 三種系統(tǒng)IgM抗體定性檢測結(jié)果與核酸檢測結(jié)果符合率為65.2%～86.9%，A系統(tǒng)、C系統(tǒng)與核酸檢測結(jié)果存在明顯差異（P均<0.05），B系統(tǒng)與核酸檢測結(jié)果無明顯差異（P>0.05）。見表4。

表3 三種系統(tǒng)IgG抗體定性檢測結(jié)果與核酸檢測結(jié)果一致性比對［例（%）］

表4 三種系統(tǒng)IgM抗體定性檢測結(jié)果與核酸檢測結(jié)果一致性比對［例（%）］

3 討論

《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（第七版）》中提出，確診病例應(yīng)包含以下三者之一：①實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性；②病毒基因測序與已知的新型冠狀病毒高度同源；③血清新型冠狀病毒特異性IgG、IgM抗體陽性［8］。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（第八版）》將特異性IgM抗體陽性作為疑似病例診斷依據(jù)之一［11］，SARS-CoV-2特異性抗體檢測有著不可替代的重要臨床和公共衛(wèi)生價(jià)值［12］。

本研究中的三種檢測系統(tǒng)均采用磁微粒化學(xué)發(fā)光法，結(jié)果顯示三種系統(tǒng)檢測SARS-CoV-2特異性IgG、IgM抗體的精密度均符合廠家聲明的生物醫(yī)學(xué)變異范圍，可保證檢測結(jié)果的重復(fù)性。對三種系統(tǒng)特異性IgG抗體定量結(jié)果進(jìn)行passing-bablok回歸分析，回歸方程的r為0.835～0.871，截距為0.017～0.025，斜率為0.034～0.173，r均大于0.8，表明三種系統(tǒng)的結(jié)果兩兩比較均高度相關(guān)，其中A系統(tǒng)與B系統(tǒng)間相關(guān)性最佳；同時(shí)三種系統(tǒng)特異性IgG抗體定性結(jié)果與核酸檢測結(jié)果符合率為91.3%～95.6%；對三種系統(tǒng)特異性IgM抗體定量結(jié)果進(jìn)行passing-bablok回歸分析，各回歸方程r為0.671～0.885，截 距 為-0.09～0.025，斜 率 為0.098～0.437，三種系統(tǒng)結(jié)果兩兩之間相關(guān)性良好，以A系統(tǒng)與C系統(tǒng)的相關(guān)性最佳；三種系統(tǒng)SARS-CoV-2特異性IgM抗體定性結(jié)果與核酸檢測結(jié)果符合率為65.2%～86.9%。

本研究結(jié)果顯示，三種系統(tǒng)IgG檢測結(jié)果一致性良好，與臨床診斷符合率高；而IgM各系統(tǒng)間檢測結(jié)果一致性并不理想，與最終臨床診斷也存在差異。其原因可能與以下因素有關(guān)：①試劑盒抗原質(zhì)量、包被質(zhì)量、標(biāo)記物包被質(zhì)量等都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響［13］；②試劑包被抗原點(diǎn)位的選擇不同可導(dǎo)致不同品牌試劑檢測結(jié)果存在差異；③IgM抗體是病毒感染后首先產(chǎn)生的抗體，本身維持時(shí)間短，存在檢測的空窗期，導(dǎo)致在感染早期或末期可能無法測出；④不同廠家采用的原理不同，檢測靈敏度也不同。

由于抗原抗體反應(yīng)的特殊性，難免會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對臨床診斷造成一定的困擾。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室工作實(shí)際，假陽性結(jié)果與以下因素有關(guān)：①陽性預(yù)判值設(shè)定過低。陽性判斷值一般是通過測定大量的陰性人群和一定數(shù)量的已知陽性人群標(biāo)本，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后得到陽性預(yù)判值，由于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的局限性，不可避免地會有一部分弱陽性結(jié)果實(shí)際上為假陽性。同時(shí)，由于不同廠家的靈敏度和特異度存在差異，陽性預(yù)判值的設(shè)定原則也不相同，也會造成不同儀器檢測結(jié)果間的差異。②血清中存在內(nèi)源性的干擾物質(zhì)，如類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、溶菌酶、補(bǔ)體和因使用鼠抗體治療而產(chǎn)生的抗鼠抗體等，均可能產(chǎn)生非特異性的結(jié)合，造成假陽性結(jié)果。③外源性干擾物質(zhì)，如標(biāo)本溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過長、標(biāo)本凝固不全等，可能影響化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過程，造成假陽性。④環(huán)境因素：因生物安全的要求，在日常工作中檢驗(yàn)科要用到含氯消毒劑噴灑或過氧化氫噴霧，空氣中存在強(qiáng)氧化劑，可能干擾底物發(fā)光反應(yīng)過程，造成假陽性。

SARS-CoV-2是一種新發(fā)病原體，目前對該病毒檢測方法性能的了解仍有限，需要更多的臨床研究以提高不同檢測方法的效能。血清學(xué)檢測目前不單獨(dú)作為SARS-CoV-2感染的診斷依據(jù)，化學(xué)發(fā)光法檢測SARS-CoV-2抗體可以提供較高的靈敏度和特異度，是SARS-CoV-2感染篩查、診斷、療效監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查的重要檢測手段［14-15］。