二甲雙胍對(duì)糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)牙周膜成纖維細(xì)胞凋亡及p38 MAPK/NF-κB通路的影響

黃輝，于大海，黃炫賡，羅智杰

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧530001

糖尿病是臨床常見(jiàn)的慢性代謝紊亂性疾病，其高血糖環(huán)境能誘發(fā)多種并發(fā)癥，疾病負(fù)擔(dān)較重［1］。糖尿病牙周炎是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，最終因牙周支持組織破壞導(dǎo)致牙齒松動(dòng)、脫落［2-3］。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是蛋白質(zhì)、核酸等大分子自發(fā)與葡萄糖等還原單糖在無(wú)酶參與條件下生成的穩(wěn)定共價(jià)加成物，與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生相關(guān)［4］。牙周膜成纖維細(xì)胞（PDLCs）是牙周膜中最主要的細(xì)胞，其在刺激下產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)在牙周炎進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［5］。p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子κB（NF-κB）通路是炎癥相關(guān)通路，可被AGEs引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)激活，誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)［6-7］。二甲雙胍是糖尿病治療的一線用藥，研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)，抑制AGEs誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡反應(yīng)［8］，但對(duì)AGEs誘導(dǎo)PDLCs凋亡的影響尚缺乏研究。2019年8月—2020年6月，我們采用AGEs誘導(dǎo)PDLCs凋亡，觀察二甲雙胍對(duì)AGEs誘導(dǎo)的PDLCs凋亡及p38 MAPK/NF-κB通路的影響，旨在為糖尿病牙周炎的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與藥物 人PDLCs細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司，AGEs購(gòu)自英國(guó)Biorbyt公司，二甲雙胍（國(guó)藥準(zhǔn)字H20023371）購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司。

1.1.2 試劑與儀器 胎牛血清購(gòu)自澳大利亞Aus?GeneX公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自德國(guó)Merck公司，CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自哈爾濱新海基因檢測(cè)有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司，白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。p-p38 MAPK抗體、p38 MAPK抗體、NF-κB p65抗體、GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔購(gòu)自美國(guó)Santa公司。恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Shellab公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（MODEL550）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀（BD FACSCantoⅡ）購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取PDLCs細(xì)胞，加入含10%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%左右融合時(shí)傳代，傳代3次后，選擇生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 AGEs最佳作用濃度與作用時(shí)間的篩選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入培養(yǎng)液稀釋為1×105/mL，以100μL/孔接種于96孔板。將細(xì)胞分為4組，分別加入0、100、200、300μg/mL的AGEs，放入培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，48 h和72 h時(shí)，300μg/mL AGEs處理的細(xì)胞OD值較0μg/mL AGEs處理的細(xì)胞降低50%以上，故以300μg/mL和48 h作為AGEs最佳作用濃度和作用時(shí)間。

1.4 細(xì)胞分組與處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入培養(yǎng)液稀釋為1×105/mL，以100μL/孔接種于96孔板。將細(xì)胞分為對(duì)照組、AGEs組及2、4、8 mmol/L二甲雙胍組，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，AGEs組加入終濃度為300μg/mL的AGEs，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組加入終濃度為300μg/mL的AGEs及終濃度分別為2、4、8 mmol/L的二甲雙胍，培養(yǎng)48 h。

1.5 細(xì)胞增殖觀察 采用CCK-8法。收集各組細(xì)胞，加入20μL CCK-8試劑，避光條件下孵育2 h；加入200μL DMSO，避光條件下震蕩10 min。使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的光密度（OD）值。

1.6 細(xì)胞凋亡觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞密度為1×106/mL的細(xì)胞懸液。取200μL細(xì)胞懸浮液，按照AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，依次加入5μL AnnexinⅤ-FITC溶液、10μL PI染液混勻，避光條件下孵育1 h，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，以早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞量的比例表示凋亡率。

1.7 細(xì)胞中SOD、MDA水平檢測(cè) 采用ELISA法。收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液充分裂解，分別按照SOD、MDA試劑盒說(shuō)明書步驟，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm、532 nm波長(zhǎng)處的OD值，計(jì)算SOD活性和MDA含量。

1.8 細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平檢測(cè) 采用ELISA法。收集各組細(xì)胞，離心取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液OD值結(jié)果計(jì)算IL-6、TNF-α水平。

1.9 細(xì)胞p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取總蛋白50μg與蛋白上樣緩沖液混合，煮沸5 min，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h。洗膜，分別加入p-p38 MAPK抗體、p38 MAPK抗體、NF-κB p65抗體和GAPDH抗體（稀釋比例1∶500）4℃孵育過(guò)夜；洗膜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔第二抗體（稀釋比例1∶2 000），室溫孵育1 h。免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法顯色、曝光、顯影、定影、晾干，對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描。以NF-κB p65與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以p-p38 MAPK與p38 MAPK灰度值的比值表示p38 MAPK的活化程度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 對(duì)照組、AGEs組以及2、4、8 mmol/L二甲雙胍組的OD值分別為0.59±0.06、0.24±0.03、0.33±0.03、0.40±0.03、0.49±0.05。與對(duì)照組相比，AGEs組OD值降低（P<0.05）；與AGEs組相比，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組OD值升高（P均<0.05），其中8 mmol/L組高于2、4 mmol/L組，4 mmol/L組高于2 mmol/L組（P均<0.05）。

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況比較 對(duì)照組、AGEs組以及2、4、8 mmol/L二甲雙胍組的細(xì)胞凋亡率分別為8.02%±1.11%、47.46%±3.86%、35.88%±3.97%、28.93%±3.72%、15.24%±1.69%。與對(duì)照組相比，AGEs組細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與AGEs組相比，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組細(xì)胞凋亡率降低（P均<0.05），其中8 mmol/L組低于2、4 mmol/L組，4 mmol/L組低于2 mmol/L組（P均<0.05）。

2.3 各組細(xì)胞中SOD、MDA水平比較 與對(duì)照組相比，AGEs組細(xì)胞中SOD活性降低，MDA水平升高（P均<0.05）；與AGEs組相比，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組細(xì)胞中SOD水平升高，MDA水平降低（P均<0.05），其中8 mmol/L組SOD高于、MDA低于2、4 mmol/L組，4 mmol/L組SOD高于、MDA低于2 mmol/L組（P均<0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 各組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平比較 與對(duì)照組相比，AGEs組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平升高（P均<0.05）；與AGEs組相比，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平降低（P均<0.05），其中8 mmol/L組低于2、4 mmol/L組，4 mmol/L組低于2 mmol/L組（P均<0.05）。見(jiàn)表2。

表1 各組細(xì)胞中SOD、MDA表達(dá)水平比較（xˉ±s）

表2 各組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，xˉ±s）

2.5 各組細(xì)胞中p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，AGEs組細(xì)胞中p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)均升高（P均<0.05）；與AGEs組相比，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組細(xì)胞中p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)均降低（P均<0.05）；其中8 mmol/L組低于2、4 mmol/L組，4 mmol/L組低于2 mmol/L組（P均<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞中p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（xˉ±s）

3 討論

AGEs是葡萄糖等還原糖的醛基與蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)的氨基基團(tuán)經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜反應(yīng)，在非酶促條件下形成的穩(wěn)定共價(jià)加成物，能與其相應(yīng)受體RAGEs相互作用或直接修飾蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而引起機(jī)體各類細(xì)胞的炎癥等反應(yīng)［9-10］。PDLCs是牙周結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，能夠合成并分泌多種細(xì)胞因子，在牙周組織的形成和再生、牙周組織的改建、牙周膜組織的完整性維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用［11］。本研究結(jié)果顯示，在不同濃度AGEs的作用下，PDLCs細(xì)胞增殖能力均顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，表明AGEs可影響PDLCs細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程。

二甲雙胍是一線口服降糖藥，能有效降低血糖，且不良反應(yīng)小。近年研究表明，二甲雙胍還具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等生物學(xué)特性［12］。ZHOU等［13］報(bào)道，二甲雙胍可以有效治療糖尿病牙周炎小鼠的牙周感染和組織破壞，并降低血糖及血清IL-1β水平。本研究結(jié)果顯示，與AGEs組相比，不同濃度二甲雙胍組細(xì)胞增殖能力均顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；且二甲雙胍越高，其促進(jìn)細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞凋亡的效果越明顯。這表明二甲雙胍對(duì)AGEs誘導(dǎo)的PDLCs細(xì)胞凋亡具有抑制作用，同時(shí)促進(jìn)其增殖再生。

SOD、MDA分別為氧化應(yīng)激反應(yīng)中的抗氧化應(yīng)激標(biāo)志物及氧化應(yīng)激標(biāo)志物。改善機(jī)體氧化應(yīng)激水平是治療糖尿病牙周炎的的重要作用機(jī)制［14］。ARAúJO等［15］報(bào)道，50 mg/kg二甲雙胍可以減輕結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎大鼠的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和骨質(zhì)流失。金領(lǐng)微等［16］報(bào)道，二甲雙胍能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)減輕腎缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果顯示，加入二甲雙胍干預(yù)后，PDLCs細(xì)胞中SOD水平升高、MDA水平降低，提示二甲雙胍可通過(guò)上調(diào)SOD水平、下調(diào)MDA水平，抑制AGEs在PDLCs細(xì)胞中引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

IL-6、TNF-α均為重要的炎癥因子，在慢性炎癥狀態(tài)下大量產(chǎn)生，促使炎癥狀態(tài)不斷延長(zhǎng)，加重對(duì)牙周組織的破壞［17］。研究顯示，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激同為糖尿病牙周炎的重要發(fā)病機(jī)制［14］。QU等［18］報(bào)道，二甲雙胍可抑制脂多糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，PDLCs細(xì)胞加入AGEs后，細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平顯著升高，提示AGEs可誘導(dǎo)炎癥因子IL-6、TNF-α大量釋放。給予二甲雙胍干預(yù)后，PDLCs細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平均降低，提示二甲雙胍可抑制AGEs引起的炎癥反應(yīng)。

NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在不同類型細(xì)胞中存在，能控制多種基因的表達(dá)。正常情況下，NF-κB處于非活化狀態(tài)，以功能性亞基p65和抑制性亞基IκBα結(jié)合的復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，應(yīng)激反應(yīng)條件下，IκBα被降解，p65被釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，直接與DNA結(jié)合引起基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控［6，19］。p38 MAPK是NF-κB的上游激酶，屬于應(yīng)激性蛋白激酶，在炎癥因子、氧化應(yīng)激等作用下激活，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核中進(jìn)一步誘導(dǎo)NF-κB活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子［20-21］。本研究結(jié)果顯示，加入AGEs后，PDLCs細(xì)胞p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高，提示AGEs可激活p38 MAPK/NF-κB通路可能進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥因子IL-6、TNF-α大量釋放［22］。給予二甲雙胍干預(yù)后，PDLCs細(xì)胞中p-p38 MAPK/p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)降低，提示二甲雙胍可降低p38 MAPK磷酸化及NF-κB活化水平，可能通過(guò)降低AGEs引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制p38 MAPK/NF-κB通路激活，減輕炎癥反應(yīng)程度［23］。

綜上所述，二甲雙胍可降低AGEs誘導(dǎo)的PDLCs細(xì)胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并通過(guò)抑制p38 MAPK/NF-κB通路活性降低炎癥反應(yīng)程度，從而抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖，可能為二甲雙胍治療糖尿病牙周炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。