TGF-β1對大鼠腎小球系膜細胞纖維化蛋白及長鏈非編碼RNA uc.412表達的影響

楊思慧，王錦，黃嬋，安夢如，張愛青，甘衛華

南京醫科大學第二附屬醫院，南京210003

慢性腎臟病（CKD）是由多種原因引起的慢性腎臟結構及功能障礙，腎纖維化是其主要病理學基礎。轉化生長因子β1（TGF-β1）具有調節細胞生長、分化、凋亡和遷移等多種生物學活性，能夠介導腎小球系膜纖維化，是腎臟纖維化發病機制中的關鍵介質［1-3］。Smad蛋白是TGF-β下游的主要效應蛋白，在腎臟受到各種病理性因素（缺血、缺氧或高糖等）和外界環境誘導因素時，活化的TGF-β1結合Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受體以及受體相關Smad（R-Smad），即Smad2和Smad3；磷酸化的Smad2/3與Smad4形成低聚物，進入細胞核調控下游靶基因的轉錄，誘導纖維化相關蛋白α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）及膠原蛋白（Collagen）形成，進一步誘導腎小管上皮—間充質轉化（EMT），從而促進腎纖維化［4-5］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）雖然不參與編碼蛋白質，但可作為重要的調控分子發揮多種生物學功能，在某些細胞的增殖調控中發揮重要作用［6］。本課題組前期通過高通量lncRNA微矩陣芯片技術在TGF-β1處理的系膜細胞中篩選出lncRNA uc.412，證實其表達與系膜細胞增殖密切相關，但其在系膜細胞中的具體生物學功能尚不明確［7-9］。SIS3是Smad3磷酸化特異性抑制劑，2020年6—11月，本研究采用SIS3抑制TGF-β1誘導的Smad3磷酸化，觀察TGF-β1誘導大鼠腎小球系膜細胞纖維化蛋白表達的作用，并進一步探討其作用機制與lncRNA uc.412的關系，為臨床防治腎纖維化相關的CKD奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1細胞株購自中國典型培養物保藏中心。過表達慢病毒lncRNA uc.412購自上海吉凱基因科技有限公司，1型膠原蛋白（Collagen-1）、α-SMA抗體購自美國Abcam公司，TGF-β1購自Novoprotein公司，SIS3購自MCE公司，低糖DMEM培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco公司，GAPDH購自Affinity公司，二抗兔IgG、二抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒購自凱基生物，TRIzol試劑購自Invitrogen公司，PCR試劑盒購自TaKaRa公司，PCR引物由上海銳真生物合成。

1.2 細胞培養 將HBZY-1細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基（含100 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素）中，37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。每天于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，2～3 d更換培養基，當細胞融合率達到80%～90%時，加入0.25%胰酶進行消化傳代。當細胞長至60%～70%融合時，用無血清培養基繼續培養24 h，使細胞生長同步化。取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3 細胞lncRNA uc.412表達檢測 采用Real-time PCR法。取對數生長期細胞，按（2～8）×105/孔接種至6孔板，隨機分為對照組、TGF-β1組、TGF-β1+SIS3組。對照組僅加入培養基，TGF-β1組加入10 ng/mL TGFβ1，TGF-β1+SIS3組同時加入10 ng/mL TGF-β1和1μmol/L SIS3，繼續培養24 h。收集各組細胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。配置10μL PCR反應體系，以β-actin作為內參，參照PCR試劑盒說明書進行Real-time PCR。引物序列：lncRNA uc.412上游5'-CTTGAATTCCAAGCAGCA?CA-3'，下游5'-CAGCAATTAATCCCCCAAGA-3'；βactin上游5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。反應體系（20μL）：SYBR 5μL，上下游引物各0.4μL，Rox 0.2μL，cDNA 1μL，ddH2O 3μL。反應條件：預變性95℃30 s；變性95℃5 s；退火60℃34 s；延伸60℃1 min，40個循環；降溫50℃30 s。通過熔解曲線分析擴增產物的特異性，2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。每個樣本設置3個復孔，實驗重復3次。

1.4 細胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3表達檢測采用Western blotting法。細胞分組與干預方法同“1.3”。收集各組細胞，加入蛋自裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液。BCA法進行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液，變性處理（95℃，10 min）。取30μg蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入一抗（稀釋比例為1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次；加入二抗（稀釋比例為1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次。加入ECL發光液顯色，凝膠成像系統圖像掃描，Image J軟件測定灰度值。以GAPDH作為內參，計算目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值的比值，作為目的蛋白的相對表達量。

1.5 過表達lncRNA uc.412對腎小球系膜細胞纖維化蛋白表達的影響觀察

1.5.1 細胞分組與慢病毒轉染 取對數生長期細胞，接種于6孔板，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。待細胞融合率達到60%～70%，加入無血清DMEM培養基繼續培養24 h，使細胞生長同步化。將細胞分為對照組、過表達組和病毒空載組，過表達組加入lncRNA uc.412過表達病毒液，病毒空載組加入不含lncRNA uc.412的慢病毒液，對照組加入等量培養基，繼續37℃培養24 h。

1.5.2 細胞Collagen-1、α-SMA mRNA表達檢測采用Real-time PCR法。PCR引物序列：α-SMA上游5'-AACTATGCTTCTGGACGTACAA-3'，下 游5'-CATAGCCCTCATAGATAGGCAC-3'；Collagen-1上游5'-AAAGATGGACTCAACGGTCTC-3'，下游5'-CAG?GAAGCTGAAGTCATAACCA-3'。具體操作步驟參照“1.3”。

1.5.3 細胞Collagen-1、α-SMA蛋白表達檢測 采用Western blotting法。具體操作步驟參照“1.4”。

1.6 統計學方法 采用GraphPad Prism8統計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞lncRNA uc.412表達比較 見表1。與對照組比較，TGF-β1組lncRNA uc.412表達升高；與TGF-β1組比較，TGF-β1+SIS3組lncRNA uc.412表達下降（P均<0.01）。

表1 各組細胞lncRNA uc.412表達水平比較（±s）

表1 各組細胞lncRNA uc.412表達水平比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.01；與TGF-β1組相比，#P<0.01。

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2.2 各組細胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3蛋白表達比較 見表2。與對照組比較，TGF-β1組細胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3蛋白表達升高（P均<0.05）；與TGF-β1組 比 較，TGF-β1+SIS3組 細 胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3蛋白表達下降（P均<0.05）。

表2 各組細胞Collagen 1、α-SMA及p-Smad3蛋白表達水平比較（±s）

表2 各組細胞Collagen 1、α-SMA及p-Smad3蛋白表達水平比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與TGF-β1組相比，#P<0.05，##P<0.01。

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2.3 過表達lncRNA uc.412對細胞纖維化蛋白及mRNA的影響 見表3。與對照組相比，病毒空載組Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達無明顯變化（P均>0.05），過表達組Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達均升高（P均<0.05）。

表3 各組細胞Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達水平比較（±s）

表3 各組細胞Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達水平比較（±s）

注：與對照組、病毒空載組相比，*P<0.05。

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3 討論

了解腎纖維化的分子發病機制，對開發CKD的新型治療策略有重要作用。腎臟纖維化是一個復雜的過程，主要病理表現為細胞外基質沉積和纖維細胞過度增殖，共同導致腎間質、腎小球硬化及慢性炎癥細胞浸潤，引起各種誘因導致的慢性腎臟疾病［10］。研究表明，進行性腎纖維化是由多種介質通過多種途徑介導的，包括生長因子、細胞因子、代謝毒素和應激分子等，其中TGF-β1是腎臟纖維化的發病機制中的關鍵介質。TGF-β1是TGF-β超家族的成員，具有調節細胞生長、分化、凋亡和遷移等多種生物學過程［11］。本研究結果顯示，腎小球系膜細胞中加入TGF-β1處理后，纖維化相關蛋白Collagen-1、α-SMA蛋白表達升高，證實TGF-β1可以誘導腎小球系膜纖維化。

lncRNA在某些細胞的增殖調控中發揮重要作用。近年來，關于lncRNA與腎臟疾病的研究越來越多，已有文獻報道lncRNA參與腎纖維化［12］。FENG等［13］報道，在輸尿管梗阻性腎病（UUO）和抗腎小球基底膜腎小球性腎炎（抗GBM-GN）小鼠中，發現151個Smad3依賴性的lncRNA，其中Erbb4-IR是通過下調Smad7來導致TGF-β/Smad3介導腎纖維化。WANG等［14］報道，TGF-β/Smad3相互作用長非編碼RNA（lnc-TSI）受Smad3轉錄調控，并特異性抑制TGF-β誘導的Smad3磷酸化和下游纖維化基因表達，從而阻止Smad3與獨立于Smad7的TGF-β受體1相互作用，抑制腎臟纖維化。因此，研究lncRNA對于治療腎纖維化導致的慢性腎臟疾病具有重要意義。lncRNA uc.412基因全長268 bp，位于人類17號染色體q12片段，其表達水平與系膜細胞增殖程度有關。本研究結果顯示，腎小球系膜細胞加入TGF-β1后，與對照組相比，TGF-β1組lncRNA uc.412表達明顯上調；建立過表達lncRNA uc.412的系膜細胞模型，發現過表達組纖維化相關蛋白Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達均顯著增加。這表明lncRNA uc.412參與介導腎小球系膜纖維化，但TGF-β1通過lncRNA uc.412調控系膜纖維化的機制有待進一步研究。

Smad蛋白家族是TGF-β下游的主要效應蛋白，在腎臟受到各種病理性因素（如缺血、缺氧或高糖等）和外界環境誘導因素影響時，TGF-β受體被激活，與下游底物Smad蛋白家族結合，形成復合體轉移入細胞核，調控下游基因轉錄，進一步誘導腎小管上皮間充質轉化，從而促進腎纖維化。其中Smad3是有效的致纖維化因子，敲除Smad3有效減輕腎臟纖 維 化［1］。XU等［15］發 現，敲 除Smad3可 降 低lncRNA Erbb4-IR轉錄，同時增加miR-29b轉錄，保護小鼠腎臟免受進行性腎損傷，Smad3可能成為糖尿病腎病的新型有效治療靶標。ZHOU等［16］在Smad3野生型/敲除型的小鼠上構建單側輸尿管結扎誘導的腎臟纖維化模型，發現lncRNA np_5318和np_17856參與了TGF-β1介導的腎纖維化，并可能成為腎臟纖維化的潛在治療靶點。因此推測，TGF-β1可能通過與下游Smad3信號通路上調lncRNA uc.412，進而促進系膜細胞纖維化相關蛋白表達。SIS3是Smad3的特異性抑制劑，可抑制TGF-β1誘導的Smad3磷酸化。JI等［17］研究發現，SIS3通過抑制單側輸尿管結扎小鼠腎臟中的TGF-β/Smad3信號轉導通路，改善了腎組織纖維化、細胞凋亡及炎癥。本研究結果顯示，與TGF-β1組比較，TGF-β1+SIS3組p-Smad3水平下調，證實SIS3能特異性抑制Smad3磷酸化；用SIS3干預后，與TGF-β1組相比，TGF-β1+SIS3組Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達顯著降低，證實TGF-β1通過Smad3信號途徑誘導系膜細胞纖維化蛋白表達增加；與TGF-β1組相比，TGF-β1+SIS3組系膜細胞lncRNA uc.412表達降低，提示TGF-β1可以通過Smad3信號通路上調lncRNA uc.412表達，從而參與腎小球系膜纖維化的進程。

綜上所述，TGF-β1能夠誘導腎小球系膜纖維化，其作用機制可能是通過Smad3信號通路上調lncRNA uc.412表達從而發揮作用，提示lncRNA uc.412可能具有治療CKD的潛在前景，但其具體機制仍有待進一步深入研究。