聚乙烯醇聯合藻酸鈣與兔軟骨細胞共培養對兔膝關節軟骨缺損修復的影響

王曉希，趙曉萌 ，余向前，趙文國，李志強

隨著現代骨科學的迅速發展，膝關節軟骨損傷修復的方法、技術、設備不斷完善。藻酸鈣(CaAlg)三維立體支架是目前常見的軟骨缺損填充物之一，對缺處的磨損有較好的修復作用[1-2]。CaAlg三維立體支架內培養的軟骨細胞，對軟骨細胞的增殖具有促進作用。本研究旨在以聚乙烯醇(PVA)與CaAlg為材料，結合支架內細胞培養技術[1]制作多孔的、可滲透的復合支架，探討PVA聯合CaAlg(PVA/CaAlg)與兔軟骨細胞(ATDC-5)共培養對兔膝關節軟骨缺損修復的影響，以及對胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的mRNA表達及Ⅱ型膠原分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級4周齡新西蘭白兔3只，體重0.9～1.1(1.0±0.1)kg，清潔級成年新西蘭白兔20只，體重2.9～3.1(3.0±0.1)kg，雌雄不限。實驗動物由華北理工大學實驗動物中心提供(批準號:GB/T35823-2018)。動物在實驗前適應性飼養1周，自由飲食和攝水，每天光照12 h，環境溫度21～23(22±1) ℃。

1.2 材料與試劑PVA(聚合度為97%，百靈威科技有限公司)、胎牛血清(Gibco公司)，Ⅱ型膠原酶I抗(北京博奧森生物技術有限公司)，通用型Ⅱ抗、PBS緩沖液、DAB顯色劑(北京中杉金喬生物技術有限公司)，DMEM培養基(大連美倫生物技術有限公司)，青霉素-鏈霉素雙抗、海藻酸鈉、氯化鈣[艾康生物技術(杭州)有限公司]，RT-PCR引物(愛康生物科技有限公司)，Trizol(Invitroge公司)，水合氯醛(洛陽市洛龍區豫科環試化工商店)，HE染色試劑盒[博苑生物科技(上海)有限公司]。

1.3 實驗儀器與器械二氧化碳培養箱(三洋公司)，雙人單面超凈工作臺SW-CJ-1BU(博迅醫療生物儀器股份有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠)，光學顯微鏡CX41-12C02、掃描電鏡SU8010(奧林巴斯公司)，可見分光光度計722N(上海光學儀器廠)，電子天平JA2005(北京中西遠大科技有限公司)，高速離心機(北京醫學離心機廠)，RT-PCR熱循環儀CFX96(Bio-Rad公司)，病理切片機YD1508B(金華市益迪醫療設備有限公司)，蓋玻片、載玻片、一次性吸管、無菌離心管[諾爾曼生物技術(南京)有限公司]，無菌培養皿、培養瓶[博苑生物技術(上海)有限公司]，外科手術器械(上海浦東金環醫療用品股份有限公司)。

1.4 樣品制備

1.4.1ATDC-5細胞的制備與培養 處死3只4周齡新西蘭白兔，碘伏反復消毒皮膚3次以上，外側髕骨旁做切口，剝開兔皮，游離雙下肢肌肉組織，暴露膝關節(切勿損傷關節囊)，截取雙側膝關節，取膝關節軟骨，碘伏消毒后放入無菌培養皿，轉移至超凈工作臺，用PBS緩沖液充分沖洗直至表面無碘伏。再用刀片小心取下表面的軟骨組織，將其放入燒杯中，再次用PBS緩沖液沖洗至無色。剪碎軟骨組織放入50 ml立式離心管中，加入0.2%Ⅱ型膠原酶，37 ℃下消化60 min。消化結束后，用吸管吸出多余的消化液，150目尼龍篩網過濾，過濾后放入離心管中加入DMEM終止消化，于1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，反復吹打成混懸液，于含5%的胎牛血清的DMEM培養基中培養，光鏡下觀察細胞的形態與密度。大約每隔2 d更換1次培養液，若光鏡下觀察到軟骨細胞完全貼壁80%左右，即可傳代。將兔ATDC-5細胞傳至第2代，HE染色觀察兔ATDC-5細胞的形態變化，免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原的分泌情況。

圖1 PVA/CaAlg材料

1.4.2PVA/CaAlg材料的制備與兔ATDC-5細胞三維培養冷凍-解凍循環法制備復合物 采用超濾法去除海藻酸鈉溶液及氯化鈣溶液中的熱原及微生物后，將氯化鈣濃度調至3 mol/L、海藻酸鈉濃度調至4%后混合攪拌均勻，此時其溶脹率達到最大，獲得CaAlg凝珠后，溶解一定量的PVA，在90 ℃下油浴，加熱不斷攪拌4 h，再加入CaAlg攪拌4 h，最后靜置脫泡。將混合液倒入模具中，于-20 ℃冰箱中冷凍成型，12 h后取出，在室溫下解凍6 h。重復上述冷凍解凍過程5次。將PVA與CaAlg的濃度比例調節為3 ∶7，置于-50 ℃下進行冷凍干燥，最終形成多孔的PVA/CaAlg材料 (見圖1)，并采用高溫蒸汽滅菌法測定PVA/CaAlg材料的無菌性。 滴入兔ATDC-5 懸液淹沒PVA/CaAlg材料，2周后HE染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色，檢查PVA/CaAlg材料內兔ATDC-5細胞的活性。

1.4.3兔膝關節缺損模型制備及分組 按隨機數字表法將20只成年新西蘭白兔分為對照組、實驗組，每組10只。兩組按劑量3 ml/kg腹腔注射15%水合氯醛麻醉，仰臥固定于手術臺，使雙下肢處于伸直狀態。常規碘伏消毒3次，以右膝關節內側做橫向切口1 cm，逐層分離，暴露內側副韌帶。定位關節腔位置，切斷內側副韌帶，可見內側半月板和關節腔，再用小剪刀進入關節腔剪斷前后交叉韌帶，充分暴露關節面，在下端右膝關節軟骨造缺損模型。對照組：缺損區不做處理，每5 d向右膝關節腔內注射生理鹽水2 ml；實驗組：植入共培養后的PVA/CaAlg復合物，術后5 d內局部注射慶大霉素預防感染，12周后對缺損區組織進行HE染色、免疫組化染色、RT-PCR定量分析IGF-1的mRNA表達。

1.5 軟骨組織HE染色12周后，兩組動物全部處死，將右膝關節上下折斷，轉移至超凈工作臺，剔除多余的肌肉組織，打開關節腔，充分暴露缺損處，用PBS緩沖液洗凈后固定于4%多聚甲醛中，避光下固定24 h后，再用流水不斷沖洗24 h，予以常規石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察軟骨組織病理學變化。

1.6 Ⅱ型膠原免疫組化染色光鏡下觀察細胞爬片情況，PBS緩沖液沖洗3遍，每次2 min；滴加Trypsin-EDTA進行修復20 min，PBS緩沖液沖洗3遍，每次2 min；再滴加3% H2O2封閉液10 min，PBS緩沖液沖洗3遍，每次2 min；接著將通用型Ⅱ抗滴加到切片上，在37 ℃下孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3遍，每次2 min；再滴加DAB顯色劑，室溫下顯色5 min，光鏡下觀察終止顯色；最后進行HE染色，二甲苯透明及中性樹膠封片，觀察修復處軟骨細胞的膠原分泌情況。

1.7 RT-PCR定量分析IGF-1的mRNA表達采取氯仿法提取瘢痕組織RNA，紫外吸收法測定其純度和濃度。用Trizol法提取總RNA，擴增條件：94 ℃ 預變性下5 min ；變性94 ℃下40 s，退火55 ℃ 下50 s，延伸72 ℃下50 s，共35個循環。引物由浙江愛康生物科技有限公司合成，GAPDH基因mRNA內參，上游引物5′-CCA-CAT-CGC-TCA-GAC-CAT-3′，下游引物5′-ACG-GTG-CCA-TGG-AAT-TTG-CCI-3′。具體步驟如下：精密稱取200 mg軟骨組織，加入Trizol溶液1 ml，剪碎，震蕩30 s，加入0.2 ml氯仿，室溫下劇烈震蕩30 s，于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，加入相同體積量的異丙醇溶液，-20 ℃下放置30 min后，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，離心后可見底部有少量的RNA。再棄去上清液，加入1 ml 75%乙醇，震蕩搖勻，連續洗滌2次，于4 ℃ 7 500 r/min離心10 min，棄去上清液，再用濾紙吸走殘余液體，室溫下干燥10 min。利用光譜分析A260/A280的比值(范圍為1.8～2.1)檢測RNA提取后的純度，-80 ℃保存備用。按照下列順序依次加入試劑：RT-PCR緩沖液25 μl、MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μl、上游引物和下游引物各2.0 μl、0.2 μl Tap DNA聚合酶以及1 mg/L DNA模板2.0 μl。最后按照上述擴增條件在RT-PCR熱循環儀上進行擴增并進行對比分析。

2 結果

2.1 兔ATDC-5細胞形態及組織學檢查光鏡下觀察，第2代兔ATDC-5細胞貼壁良好，少部分細胞正在分裂增殖，此時細胞呈橢圓形、多角形，見圖2。原代軟骨細胞培養72 h后，HE染色顯示軟骨細胞形態良好，細胞形態多呈卵圓形、多角形；細胞核為圓形或橢圓形，胞液豐富，著色明顯，部分細胞伸出偽足，見圖3A；在光鏡下觀察，Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示細胞胞質呈棕黃色，細胞生長地方棕色較深，見圖3B。

2.2 PVA/CaAlg復合物內細胞形態及組織學檢查2周后對PVA/CaAlg復合物進行HE染色，結果顯示兔ATDC-5細胞表型正常，部分細胞分裂，細胞核著色呈藍色，細胞內液豐富，呈淡紅色，支架結構完整，見圖4A；Ⅱ型膠原免疫組化染色結果顯示，細胞胞質呈棕黃色，細胞內外均可見到棕色顆粒狀，見圖4B。

2.3 缺損區修復狀況的對比檢查與實驗組相比，對照組膝關節缺損區明顯瘢痕組織增生，關節面不平整，伴有大量的關節液增加現象，見圖5。HE染色結果顯示對照組缺損區細胞及組織結構排列紊亂，軟骨細胞較少，纖維組織顯著增多，無新生血管長入，實驗組缺損區細胞及組織結構排列較整齊，軟骨細胞多，細胞核微小、聚集，纖維組織較少，見圖6。表明PVA/CaAlg與軟骨細胞共培養能促進細胞增殖的同時纖維組織在逐漸減少。通過免疫組化染色在光鏡下可明顯觀察到：能分泌Ⅱ型膠原的軟骨細胞著黃褐色，對照組Ⅱ型膠原分泌較少，排列不規律，實驗組Ⅱ型膠原分泌較多，排列整齊規律，見圖7。說明PVA/CaAlg與軟骨細胞共培養可明顯促進軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原。

2.4 RT-PCR定量分析IGF-1的mRNA表達提取mRNA的純度經核酸蛋白檢測儀檢測以及擴增和溶解曲線分析表明，無明顯雜質，符合實驗要求。結果顯示， IGF-1的mRNA表達量對照組低于實驗組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖8。

3 討論

關節軟骨損傷后很難進行自我修復，雖然損傷后局部軟骨細胞能進行一定程度的有絲分裂，形成瘢痕和增厚的軟骨組織，并產生膠原，但新生的膠原不足以修復軟骨缺損區，增厚軟骨表層也僅僅是以成纖維細胞為主的增生，其生物力學性能不如軟骨組織，也無法承受過重負荷。這種修復僅是形態上的修復并不是完全修復，造成這種結果的原因有很多，根據我們多年經驗認為其原因如下：① 軟骨細胞增殖能力較差，蛋白多糖分子的合成、聚合與硫酸化易受內外環境因素的變化，損傷情況下炎癥因子的刺激導致其分解速率增加。② 軟骨組織基質主要有膠原及可聚蛋白聚糖，賦予了組織外形和強度，但也因其致密的結構導致缺損區缺少遷移增殖并參與修復的未分化細胞。③ 成年后，軟骨鈣化層中羥基磷灰石大量沉積導致潮線的出現，進一步減少了其營養來源[3-4]。這些原因損傷后軟骨細胞成簇狀或克隆狀增生，而沒有能力修復損傷組織及阻止損失進一步加重，只能讓損失部位及其周圍發生進一步的撕裂及啟動炎癥反應。④ 損傷后缺損區的不平整，在緩慢的修復過程中由于磨損會延緩愈合或加重損傷。以上這4種因素均影響著軟骨的自身修復作用。

圖2 第2代兔ATDC-5細胞光鏡下形態,細胞呈橢圓形、多角形 ×100 圖3 原代軟骨細胞72 h后HE染色及免疫組化染色 ×100 A.HE染色顯示細胞多為圓形或橢圓形，著色顯著，部分細胞伸出偽足;B.Ⅱ型膠原免疫組化顯示細胞胞質呈棕黃色，細胞生長地方棕色較深 圖4 PVA/CaAlg復合物HE染色及免疫組化染色 ×100 A.HE染色顯示部分細胞分裂，細胞核著色呈藍色,細胞內液呈淡紅色，支架結構完整;B.Ⅱ型膠原免疫組化顯示細胞胞質呈棕黃色，細胞內外均可見到棕色顆粒狀

IGF-1是一種多功能的細胞增殖調控因子，可促進關節軟骨細胞的增殖及活性[5]。同時兔ATDC-5細胞中IGF-1的表達情況，是反映軟骨缺損修復情況的指標之一。本實驗中，通過HE染色觀察兔ATDC-5細胞在材料上的生長情況，免疫組化檢測Ⅱ型膠原的分泌，RT-PCR檢測IGF-1的mRNA表達，發現實驗組兔ATDC-5細胞的數量、膠原的分泌、排列規律性以及IGF-1的mRNA表達明顯優于對照組，推測可能是通過PVA/CaAlg復合物與兔ATDC-5細胞共同培養，提高了IGF-1的表達，增加Ⅱ型膠原酶的分泌，從而促進對兔膝關節軟骨缺損的修復作用。

綜上所述，PVA/CaAlg復合物是一種良好的支架，這種復合支架材料具有良好的理化及生物學性能，與兔ATDC-5細胞共同培養后植入缺損區，為修復關節軟骨缺損提供了一種有效的方法。