響應面優化海風藤多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

毛月東 金青

摘要：利用超聲輔助法提取海風藤多糖，通過沙維積（Sevag）法分離、純化海風藤多糖;以單因素試驗結果為基礎，采用響應面法對海風藤多糖的提取工藝進行優化，采用自由基體外清除試驗對海風藤多糖體外抗氧化性進行探討。得出最佳超聲提取條件為提取時間50 min，液料比30 mL ∶1 g，提取溫度60 ℃，提取功率420 W;此條件下測得多糖平均得率為6.97%，相對偏差較小，該提取條件穩定可靠。體外抗氧化試驗表明，海風藤多糖質量濃度為 800 μg/mL 時，1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基與2，2′-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除率分別為81.20%、55.35%，表明海風藤多糖具有較好的抗氧化作用。

關鍵詞：海風藤;多糖;響應面法;超聲提取;抗氧化

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）08-0171-06

收稿日期：2020-07-21

作者簡介：毛月東（ 1994—），女，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事天然產物研究。E-mail：mao17866859787@163.com。

通信作者：金 青，碩士，副教授，碩士生導師，主要從事天然產物研究。E-mail：17854296528@163.com。

海風藤是一種藥用藤本植物風藤的干燥藤莖，味辛、苦，性微溫，能夠抗炎鎮痛、祛風祛濕、通經活絡、抑制血小板活化因子，保護局部缺血組織等[1-2]。多糖是海風藤的主要成分之一，多糖具有顯著的生物活性，在免疫調節、組織保護等生理過程中發揮著重要作用[3]，被廣泛應用于各種保健產品和藥物中。

自由基是人體進行正常生理活動時產生的，氧化性較強，人體內自由基濃度較大時，就會損傷正常細胞和組織，引發一系列疾病，使人體衰老加快[4-5]。植物多糖具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、免疫調節等作用[6-7]，對體內自由基有清除作用。本研究旨在通過響應面法確定海風藤多糖的最優提取工藝，通過自由基清除試驗研究海風藤多糖的抗氧化活性，以期為海風藤多糖的藥用價值和經濟價值的開發提供理論基礎[8]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海風藤：閩產海風藤（2019年9月購于青島市李滄區同仁堂）;葡萄糖標準品（四川維克奇生物科技有限公司）;1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、2，2′-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、維生素C、過硫酸鉀、苯酚、濃硫酸、雙氧水、無水乙醇、丙酮、三氯甲烷、正丁醇（以上試劑均為分析純）。

1.2 主要儀器

UV-6000 紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）;H-100S 超聲波清洗機（繁花科技有限公司）;DZF真空干燥箱（上海坤天實驗室儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 海風藤多糖的制備

海風藤烘干、粉碎、過篩，超聲加熱水提，減壓過濾、濃縮，使用活性炭進行脫色，沙維積（Sevag）法脫蛋白，加入95%乙醇，置于冰箱4 ℃沉淀過夜，離心棄去上清液，將沉淀進行真空干燥，得到海風藤多糖。

1.3.2 葡萄糖標準曲線繪制

多糖含量的測定方法使用苯酚-硫酸法，將葡萄糖標準品干燥至恒質量，精確稱取100 mg，蒸餾水溶解，定容至100 mL，稀釋得到0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液（2019年9月配制，保存于青島科技大學天然藥物化學研究室）。使用0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液配制濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列葡萄糖標準溶液，各取1 mL置于容量瓶中，加入5%苯酚1.5 mL，混勻，迅速滴加濃硫酸5 mL，充分混勻，50 ℃保溫30 min;流水冷卻至室溫，使用蒸餾水作為空白，490 nm測定吸光度，得到葡萄糖質量濃度與吸光度的回歸方程y=7.043 8x+0.072 1，r2=0.999 3。葡萄糖標準品在0.01～0.1 mg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系[9]。

1.3.3 海風藤多糖含量測定

稱取適量海風藤粉末，按“1.3.1”方法制備海風藤多糖溶液，按“1.3.2”方法對樣品溶液進行測定，依據樣品溶液吸光度計算多糖含量，根據下式計算海風藤多糖得率，計算公式如下：

海風藤多糖得率=C×V/m×100%。

式中：C為海風藤溶液多糖濃度（mg/mL）;m為海風藤樣品質量（mg）;V為提取液體積（mL）。

1.3.4 單因素試驗

分別設置不同超聲時間、溫度、功率以及液料比，探究其對海風藤多糖得率的影響。

1.3.5 響應面優化試驗

以單因素試驗結果為基礎，設定海風藤多糖得率為因變量，設置超聲時間（A）、液料比（B）、超聲溫度（C）、超聲功率（D）4個因素為響應面自變量，采用四因素三水平中心組合響應面法對海風藤多糖提取工藝進行優化（表1）。

1.3.6 海風藤多糖純化

取制備的海風藤多糖提取液，使用活性炭脫色，Sevag法脫蛋白，加入5倍量95%乙醇，4 ℃冰箱中靜置過夜，將脫蛋白溶液離心，棄去上清液，將下層沉淀進行減壓干燥，得粗多糖，計算純化后多糖得率[10]。計算方法如下式：

純化海風藤多糖得率=純化后海風藤多糖質量/海風藤樣品質量×100%。

1.3.7 海風藤多糖抗氧化性研究

1.3.7.1 DPPH自由基清除試驗

稱取適量海風藤多糖，配制不同濃度的海風藤多糖溶液和 0.2 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液，取海風藤多糖溶液和DPPH溶液各2 mL，混勻后靜置30 min，在 517 nm 測定吸光度D1，同樣方法測定2 mL 95%乙醇和2 mL海風藤多糖溶液充分混勻后的吸光度為D2，2 mL DPPH 溶液與2 mL 蒸餾水混合后的吸光度為D0，同時用維生素C標準品作為對照[11-13]。

DPPH自由基清除率=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

1.3.7.2 ABTS自由基清除試驗

將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L的K2S2O8溶液混合（體積比1 ∶1），在室溫條件下暗處反應12～16 h，得到ABTS儲備液。ABTS儲備液用70%乙醇稀釋，直至在734 nm下測定的吸光度為0.7±0.02。精確量取1 mL樣品溶液，加入3 mL ABTS溶液，充分混勻，室溫下反應6 min，測定734 nm吸光度為D1′，同法以蒸餾水代替樣品測定吸光度D0′，以溶劑代替樣品溶液測定吸光度D2′，維生素C作為對照，平行3次測定[14-15]。

ABTS自由基清除率=[1-（D1′-D2′）/D0′]×100%。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲時間對海風藤多糖得率影響

準確稱取海風藤粉末2.00 g，加入30倍量蒸餾水，設置超聲溫度60 ℃，超聲功率480 W，超聲時間分別為10、20、30、40、50 min進行試驗，每組處理3個重復。如圖1所示，海風藤多糖得率隨超聲時間的增加呈現先增加再減小的趨勢，當超聲時間為40 min 時海風藤多糖得率達到最大。其原因可能是當提取時間較短時，多糖不斷從植物組織中釋放出來，故隨時間增加，多糖得率增加;但超聲波對大分子具有機械效應，隨著超聲時間增長，超聲波對多糖分子造成破壞，從而使海風藤多糖得率下降[16]。故提取時間為40 min時，海風藤多糖提取效果最佳。

2.1.2 液料比對多糖得率的影響

準確稱取海風藤粉末2.00 g，設置超聲溫度60 ℃，超聲時間 40 min，超聲功率為480 W，液料比分別為 10mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g進行海風藤多糖提取試驗，每組處理3個重復。如圖2所示，海風藤多糖得率隨液料比的增加，呈現先增大后減小的趨勢，在液料比為 30 mL ∶1 g 時達到最大。其原因可能是當溶劑含量較少時，溶液黏度較大，多糖分子不易擴散，得率較低。隨溶劑量增加，溶液黏度降低，擴散快，得率高。液料比大于30 mL ∶1 g時，得率降低，可能是過多的溶劑會增加超聲波破碎細胞的阻力，使細胞破碎程度下降，降低多糖的溶出量[17]。故液料比在 30 mL ∶1 g 時，海風藤多糖提取效果最佳。

2.1.3 溫度對得率的影響

準確稱取海風藤粉末2.00 g，設置液料比30 mL ∶1 g，超聲時間為 40 min，超聲功率為480 W，超聲溫度分別為40、50、60、70、80 ℃進行海風藤多糖提取試驗，每組處理3個重復。如圖3所示，海風藤多糖得率隨溫度增加先增大后減小，在提取溫度為60 ℃時海風藤多糖得率達到最大。其原因可能是溫度較低時，隨著提取溫度的升高，分子熱運動加快，多糖得率亦隨之增加，而溫度達到60 ℃以上時，可能由于溫度過高多糖結構被氧化破壞，造成海風藤多糖得率降低[18-19]。故溫度在60 ℃時，海風藤多糖提取效果最佳。

2.1.4 超聲功率對得率的影響

準確稱取海風藤

粉末2.00 g，在液料比為30 mL ∶1 g，設置超聲溫度 60 ℃，超聲時間40 min，超聲功率分別為360、420、480、540、600 W進行海風藤多糖提取試驗，每組處理3個重復。如圖4所示，海風藤多糖得率隨超聲功率繼續增大呈現出先增加后減小的趨勢，在功率為420 W時海風藤多糖得率達到最大。其原因可能是超聲功率增大，超聲波的機械作用增強，對細胞的破碎作用增強，多糖得率增加。但隨著超聲功率增大，會加劇體系的空化作用，導致分子聚集并產生局部高溫。多糖分子受高溫影響容易失去活性并以沉淀形式析出，得率下降[20]。故超聲功率在 420 W 時，海風藤多糖提取效果最佳。

2.2 響應面法優化海風藤多糖提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計方案及結果 采用響應面法對海風藤多糖提取工藝進行優化，不同工藝條件下海風藤多糖提取試驗結果如表2所示。

2.2.2 響應面試驗結果分析

根據回歸系數，建立了響應面回歸方程：海風藤多糖得率Y=6.92+0.29A+0.17B+0.16C+0.16D-0.018AB+0.12AC-0.012AD-0.22BC-0.29BD-0.22CD-0.20A2-0.61B2-0.48C2-0.56D2。

由表3中的數據可知，此模型R2=0.999 4，P<0.000 1，失擬項（0.051 0）>0.01，說明該模型具有較高的可靠性，擬合效果良好。對各項影響因子的偏回歸系數進行檢驗分析結果表明：所選取的4個因素對多糖得率有極顯著影響，按影響程度從大到小依次為時間（A）>液料比（B）>功率（D）>溫度（C）;交互因素AC、BC、BD、CD對多糖得率的影響極顯著，這與李振等的研究結果[21]相符。

2.2.3 兩因素交互作用響應面分析

當響應面圖的坡度越陡峭，等高線越密集，等高線呈扁圓形時，兩因素交互作用較顯著[22]。由圖5可知，圖5-c～圖5-f坡面陡峭，等高線密集，說明AC、BC、BD、CD交互作用對海風藤多糖得率影響較為顯著，AB、AD交互作用對海風藤多糖得率影響次之。

綜合回歸模型的分析可知，海風藤多糖提取最優工藝參數：提取時間為47.71 min，液料比為 30.68 mL ∶1 g，提取溫度為62.25 ℃，提取功率為 424.42 W，此條件下海風藤多糖得率的理論值為7.06%。為驗證分析結果的可靠性，考慮到試驗方案的可行性，設定海風藤多糖提取工藝參數：提取

時間為50 min，液料比為30 mL ∶1 g，提取溫度為 60 ℃，提取功率為420 W，測得多糖平均得率為6.97%，相對標準偏差（RSD）=2.57%（n=5），相對偏差較小。因此該模型準確度較高，可用于海風藤多糖提取。

2.3 海風藤多糖純化結果

按照“1.3.6”節的方法，對海風藤多糖提取液進行純化，純化后多糖得率為5.23%，純化后得率降低，說明脫色脫蛋白過程會對多糖造成破壞，使得多糖含量降低。

2.4 海風藤多糖抗氧化活性研究

2.4.1 海風藤多糖清除DPPH自由基試驗

由圖6可知，隨著維生素C與海風藤多糖濃度的不斷提高，二者對DPPH自由基的清除率不斷增高。維生素C質量濃度在10～100 μg/mL時，DPPH自由基的清除率明顯提高，當維生素C濃度超出 200 μg/mL 時，DPPH自由基清除率增加趨勢平緩。海風藤多糖濃度在10～400 μg/mL 時，DPPH自由基的清除率明顯提高。當海風藤多糖濃度達到 800 μg/mL 時，二者對DPPH自由基的清除率分別是92.82%、81.20%。

2.4.2 海風藤多糖清除ABTS自由基試驗

由圖7可知，隨著維生素C與海風藤多糖濃度的不斷提高，二者對ABTS自由基的清除率不斷增高。維生素C質量濃度為10～200 μg/mL時，ABTS自由基的清除率明顯提高，當維生素C濃度超過 400 μg/mL 時，ABTS自由基清除率增高較為平緩。海風藤多糖質量濃度在10～600 μg/mL，ABTS自由基的清除率明顯提高。當濃度達到800 μg/mL時，維生素C、 海風藤多糖對ABTS自由基的清除率分別是93.94%、55.35%。

3 結論

本研究利用超聲波輔助方法提取了海風藤中多糖。通過對單因素試驗的結果的分析，利用響應面法得到海風藤多糖最優提取工藝條件：提取時間為50 min，液料比為30 mL ∶1 g，提取溫度為60 ℃，提取功率為420 W，多糖平均得率為6.97%。隨著海風藤多糖質量濃度的提高，對DPPH自由基與ABTS自由基清除效果也不斷增強，當海風藤多糖質量濃度為800 μg/mL時，DPPH自由基與ABTS自由基清除率分別為81.20%、55.35%。由此說明海風藤多糖具有一定抗氧化性，為海風藤多糖開發利用提供理論依據。

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