高山松miR171a及其靶基因的鑒定與表達分析

張雪如 王穩利 邱宗波 曾倩倩

摘要：以裸子植物高山松為試驗材料，利用筆者所在實驗室前期構建的高山松miRNA數據，通過生物信息學方法篩選與高山松生長發育相關的miR171a，并通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴增法（RLM-5′RACE）驗證得出，GRAS家族轉錄因子（Unigene10015）和肌動蛋白結合蛋白（Unigene83401）的基因為高山松miR171a的靶基因。通過PCR技術克隆得到的高山松miR171a前體序列可形成莖環發夾結構，但其成熟序列的堿基保守性較差。系統進化分析顯示，pde-miR171a與裸子植物火炬松的進化關系較近。經qRT-PCR分析發現，pde-miR171a在高山松莖中的相對表達量最高，其次是在針葉中，而靶基因Unigene10015在莖、針葉中的相對表達量較低，暗示pde-miR171a可以通過調控靶基因Unigene10015而參與高山松的生長發育。

關鍵詞：高山松;miR171;靶基因;熒光定量PCR

中圖分類號： S718.46文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）07-0062-05

收稿日期：2020-08-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：31500499）;河南省高?？萍紕撔氯瞬彭椖浚ň幪枺?6HASTIT019）。

作者簡介：張雪如（1996—），女，河南洛陽人，碩士研究生，主要從事植物發育生物學方面的研究。E-mail：1365655297@qq.com。

通信作者：邱宗波，博士，教授，主要從事植物分子生物學方面的研究。E-mail：qiuzongbo@126.com。

microRNA（miRNA）是一類由21～24個核苷酸組成的內源性單鏈小RNA，主要是在轉錄后水平介導靶mRNA的降解或翻譯抑制來調控基因表達[1]。自研究者從秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中發現第1個 miRNA以來，miRNA一直是研究的熱點[2]。近年來，越來越多的研究發現，miRNAs在高山松（Pinus densata）的生長發育[3]、杉木種子的萌發[4]及落葉松體胚的生長發育和形態建成等方面起著重要的調控作用[5]。

miR171是在植物中最早發現的miRNAs家族成員之一[6]，在擬南芥中有3個miRNA成員，分別是ath-miR171a、ath-miR171b和ath-miR171c[7]。通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴增（RNA ligase-mediated 5′ rapid amplification of cDNA ends，簡稱RLM-5′RACE）試驗，研究者發現水稻中的miR171能介導靶基因OsHAM（GRAS家族轉錄因子）mRNA的剪切降解，從而促進水稻營養生長向生殖生長的過渡及根尖分生組織穩態的形成[8]。楊樹miR171通過調控GRAS轉錄因子而參與楊樹的生長發育和光形態建成的調控[9]。張力等研究發現，煙草miR171c通過負調控SCL靶基因TC134811、TC127385，使植物出現頂端優勢喪失和莖稈增多等表型[10]。盡管目前關于miR171在多個植物中功能的研究較多，但目前在裸子植物高山松中，miR171的鑒定及其在高山松生長發育過程中的功能尚不清楚。

高山松是一種具有重要生態意義的裸子植物[11]。本研究根據高山松小RNA高通量測序結果獲得的miR171a，進行前體序列的克隆與分析。通過在線預測網站獲得 miR171a的靶基因，并通過RLM-5′RACE進行驗證。同時還分析了miR171a及其靶基因在高山松不同組織部位的表達特性，為揭示miR171a在高山松生長發育中的作用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2月齡的高山松幼苗于2019年5月置于溫室中培養（晝—夜生長溫度周期為 25 ℃—18 ℃，光—暗周期為16 h—8 h，相對濕度為65%～70%）。

1.2 高山松miR171前體序列的克隆及其二級結構預測

使用植物Concert Plant RNA Reagent （美國Invitrogen公司）從2月齡的高山松幼苗中提取總RNA。從筆者所在實驗室得到的高山松miRNA高通量測序數據中獲得高山松miR171a的前體序列：5′-AAAGAAUGUGAUGUUGGCUAGGCUCAAUCGGAUUGUAACGCCCACGGAAUUUGGUCUUGUGAUCUGAUUGAGCCGUGCCAAUAUCACAUUCUAAC-3′，用Primer 5.0軟件設計特異性引物進行PCR 擴增（表1）。采用Clustalx 2.0軟件，以高梁sbi-miR171a、擬南芥ath-miR171a、油菜bna-miR171a、玉米 zma-miR171a、大豆gma-miR171a、火炬松pta-miR171a、毛白楊ppt-miR171a、水稻osa-miR171a、毛果楊ptc-miR171a及卷柏smo-miR171a的成熟序列為模板進行序列比對。用MEGA 7.0構建miR171a前體序列的系統進化樹，通過RNAfold web server在線軟件預測miR171a前體序列的二級結構。

1.3 高山松miR171a靶基因的預測與切割位點的驗證

將高山松miR171a的成熟序列提交到靶基因在線預測網站psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）上，以高山松的轉錄組數據庫作為靶標，設置期望值為2.5，其余參數為默認值。將預測到的靶基因比對到GO（gene ontology）數據庫中，確定其功能。依據靶基因的cDNA序列，用Primer 5.0軟件設計用于RLM-5′RACE的引物（表1）。RLM-5′RACE試驗參照孔雷等的方法[12]，擴增出的特異產物后進行克隆測序。

1.4 實時熒光定量PCR

使用植物Concert Plant RNA Reagent （美國Invitrogen公司）分別提取2月齡高山松幼苗根、莖和針葉的總RNA。用Superscript Ⅱ reverse transcriptase （美國Invitrogen公司）進行反轉錄。熒光定量試驗使用Thunderbird SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（日本Toyobo公司）。以actin作為miR171a和靶基因Unigene10015的內參基因。利用Rotor-Gene 3000型實時PCR擴增儀檢測，每個樣品設3次生物學重復。基因相對表達量的測定采用2-ΔΔCT法（C表示循環數;T表示熒光閾值）[13]，將基因在根中的表達水平設成1。

2 結果與分析

2.1 pde-miR171a前體序列的擴增及二級結構的預測

從筆者所在實驗室前期得到的高山松miRNA高通量測序數據中篩選得到高山松miR171a的前體序列，進行引物設計，以高山松基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到高山松miR171a的前體序列長度為96 bp（圖1）。用RNAfolder軟件在線分析其二級結構，發現高山松pre-miR171a可折疊成典型的莖環發夾結構（圖 2），預測得出其二級結構的最小折疊自由能（minimal folding free energy，簡稱MFE）為-230.74 kJ/mol，最小折疊自由能指數（minimal folding free energy index，MFEI）為1.28，miR171a的成熟序列（5′-UGAUUGAGCCGUGCCA AUAUC-3′）位于莖環結構的3′端。

2.2 高山松miR171a成熟序列和前體序列的分析

對miRBase數據庫中不同植物的miR171a成熟序列與高山松miR171a（pde-miR171a）的成熟序列進行比對，發現除了高梁sbi-miR171a、pde-miR171a的成熟序列完全一致外，其他物種的miR171a如擬南芥ath-miR171a、玉米zma-miR171a、火炬松pta-miR171a、水稻osa-miR171a、油菜bna-miR171a、大豆gma-miR171a、毛白楊ppt-miR171a、毛果楊ptc-miR171a及卷柏smo-miR171a與高山松pde-miR171a的成熟序列間有1個或多個堿基的差異（圖3），表明高山松 pde-miR171a的成熟序列在不同物種中的保守性不高。用MEGA 7.0對毛白楊、玉米、卷柏、高梁、擬南芥、火炬松、大豆、水稻、油菜和高山松的MIR171a共25個成員構建系統發育樹。結果（圖4）顯示，不同物種的MIR171前體保守性不高，高山松與火炬松的前體序列聚為一類，二者間的進化關系較近。

2.3 高山松miR171a靶基因的預測及RLM-5′RACE驗證以高山松miR171成熟序列為對象、高山松轉錄組數據庫為靶標，用psRNAtarget進行pde-miR171a靶基因預測。如表2所示，pde-miR171a的靶基因分別為GRAS家族轉錄因子（Unigene10015）、肌動蛋白結合蛋白（Unigene83401） 及未知蛋白 （Unigene84522）， 其中pde-miR171a與高山松GRAS家族轉錄因子Unigene10015）的匹配程度最高。

為了進一步驗證高山松miR171a對潛在靶基因是否存在剪切作用，筆者用RLM-5′RACE方法對靶基因Unigene10015、Unigene83401 mRNA的3′ 端剪切產物進行擴增。測序結果表明，高山松 pde-miR171a對GRAS家族轉錄因子的剪切位點位于第13個至第14個堿基之間，對肌動蛋白結合蛋白的剪切位點位于經典切割位點下游第20個堿基處（圖5），表明GRAS家族轉錄因子（Unigene10015）和肌動蛋白結合蛋白（Unigene83401）的基因確實是miR171a的靶基因，miR171a可以在轉錄后水平調控GRAS家族轉錄因子和肌動蛋白結合蛋白基因的表達。

2.4 高山松pde-miR171a及其靶基因Unigene10015在不同組織中的表達分析

通過熒光定量PCR檢測pde-miR171a及其靶基因Unigene10015在高山松根、 莖和針葉中的表達情況。結果（圖6）顯示，pde-miR171a、Unigene10015在高山松不同組織中的表達情況存在差異，pde-miR171a在莖中的相對表達量最高，其次在針葉中，而靶基因Unigene10015在莖、針葉中的相對表達量最低;靶基因Unigene10015的相對表達量與pde-miR171a的相對表達量呈負相關。

3 討論與結論

隨著高通量測序技術的快速發展，對裸子植物進行高通量轉錄組測序的研究不斷增多，有助于通過生物信息學方法對miRNAs的鑒定提供數據基礎[14-16]。本研究對鑒定到的 miR171a前體基因Pre-miR171a進行克隆， 得到miR71a的前體序列長度為96 bp，可形成穩定的莖環發夾結構，說明miR171a確實在高山松中存在并表達。最小折疊自由能指數（minimal folding free energy index，簡稱MFEI）是將miRNA與其他小分子RNA區分開來的重要參數，一般植物的MFEI大于0.85[17]。在本研究中， miR71a前體的MFEI為1.28， 顯著高于黑胡椒miR171前體的MFEI（0.80）[6]，但與擬南芥[18]、水稻[8]和煙草[10]中miRNA前體的MFEI類似。這些結果為進一步研究高山松miR171a的功能奠定了基礎。

植物的成熟miRNA能通過核酸互補指導RNA誘導的沉默復合體（RISC）去切割或者抑制靶基因表達[19]。目前主要采用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends）的方法驗證miRNA對靶基因mRNA的切割作用[12]。筆者用RLM-5′RACE方法對預測的2個靶基因Unigene10015（GRAS家族轉錄因子）、Unigene83401（肌動蛋白結合蛋白）進行驗證。結果顯示，高山松miR171a介導靶基因Unigene10015（GRAS家族轉錄因子）的mRNA剪切降解，且剪切位點在第13、第14位堿基之間。通過5′RACE試驗方法發現，擬南芥中GRAS家族轉錄因子Scarecrow-Like是miR171的靶基因，切割位點也在第13、第14位堿基之間[7]。另外，高山松miR171a與靶基因Unigene83401（肌動蛋白結合蛋白）的切割位點在典型的miRNA切割位點下游第20個堿基處，這可能是由于siRNA在miRNA切割位點下游第20個核苷酸處發生的第2次切割[20]。以上結果表明，miR71a能夠通過識別、結合，然后切割相應的靶基因，從而調控高山松的生長發育。

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