低溫冷凍-超微粉碎洋薊膳食纖維對肥胖小鼠減肥作用的研究

徐田輝 朱仁威 黃 亮 付曉康 賀 便

(特醫食品加工湖南省重點實驗室；中南林業科技大學食品科學與工程學院1，長沙 410004)(稻谷及副產品深加工國家工程實驗室；中南林業科技大學食品科學與工程學院2，長沙 410004)

洋薊原產地中海西部和中部地區，在古代已傳到地中海東部地區。洋薊廣泛種植于加利福尼亞、法國、西班牙、比利時、地中海附近各國及其他土壤肥沃，氣候溫和潮濕的地區，在我國陜西省、山東省均有分布[1]。洋薊營養豐富，在每100克可食部位中，含水量80.5%，脂肪0.2%，蛋白質2.8%，糖類9.9%，維生素A為0.160%，維生素C為0.008%，鈣0.051%，磷0.069%、鐵0.001.5%[2]，還有對人類有益的菜薊素，天門冬酰胺以及黃酮類化合物等[3]。

膳食纖維是指不被人體消化吸收，也不產生能量的木質素和多糖類碳水化合物的總稱[4]。洋薊中富含膳食纖維[5]，具有促進有益的生理作用，包括促進排便、促進血液中的膽固醇和葡萄糖衰減、幫助降低便秘[6,7]、憩室病和其他消化道功能紊亂疾病的發生率[8,9]。

低溫冷凍-超微粉碎是一種創新的對膳食纖維進行復合改性的方法，其具有消耗能量低，對物料的成分破壞少，并且能夠最大程度上對物料的理化性質進行改性[10]。經低溫冷凍-超微粉碎后洋薊膳食纖維使其原有的水合性，膨脹力、持水力、持油力、葡萄糖吸附力以及結晶能力顯著增強[11]，且經過復合改性后的洋薊膳食纖維中所含的可溶性膳食纖維組分明顯增多，有利于人體腸道有益菌群的生長，給人體帶來益處[12]。目前研究的主要是洋薊的多酚類化合物、黃酮類化合物以及菜薊素等物質，鮮有關于洋薊膳食纖維的報道[13]。本研究采用經低溫冷凍-超微粉碎復合改性得到的洋薊膳食纖維飼喂肥胖小鼠，探討其對肥胖小鼠的體重、血糖血脂值、腹腔脂肪以及肝臟病變的影響，為洋薊膳食纖維的減肥作用提供參考[14]。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

50只C57BL/6小鼠，無特定病原體(specific pathogen free, SPF級，動物生產許可證號：SCXK(湘) 2016-0002)，動物質量合格證號為：110727191100 3092。

基礎飼料：蛋白質 35.6%，脂肪 44.3%，碳水化合物 20.1%；高脂飼料：基礎飼料63.6%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、蛋黃粉10%、蔗糖15%、豬油10%。

未經改性洋薊膳食纖維和低溫冷凍-超微粉碎洋復合改性薊膳食纖維，實驗室自制；奧利司他；A111-1-1型總膽固醇試劑盒、A110-1-1型甘油三酯試劑盒；檸檬酸、檸檬酸鈉、甲醛等均為分析純。

1.2 儀器與設備

DNM-9602A酶標儀，甘油三酯值16KR臺式高速冷凍離心機，GA-3型血糖儀，GA-3型血糖試紙，Pannoramic MIDI病理切片掃描儀，DW-HL388超低溫冰箱，恒溫恒濕動物房。

1.3 方法

1.3.1 洋薊基本成分測定

對未經處理洋薊膳食纖維、低溫冷凍-超微粉碎洋薊膳食纖維的水分、蛋白含量、粗脂肪、粗灰分、可溶性膳食纖維和不可溶性膳食纖維成分進行測定，分別參考GB 5009.3—2016-kw，GB 5009.5—2016，GB 5009.6—2016，GB 5009.4—2016，GB 5009.88—2014-kw)進行測定。

1.3.2 洋薊膳食纖維的復合改性

將洋薊花苞在70 ℃下干燥，通過普通粉碎后過300目篩，將制得的洋薊花苞粉通過-80 ℃超低溫冷凍8 h后，再采用納米球磨儀對低溫冷凍后的花苞粉進行超微粉碎，得到復合改性洋薊花苞粉(粉碎時間為8 h，洋薊花苞粉與鋯球質量比為1∶5)。將復合改性后的洋薊花苞粉溶于純水中，調節溶液至pH4.5，并在60 ℃的水浴中攪拌2 h與蒸餾水以1∶12(m∶V)的比例混合煮沸30 min，將溶液的pH調節至6.5，然后加入0.3%的熱穩定α-淀粉酶(耐高溫)，并在95 ℃下酶水解持續30 min。將溶液調至pH7.5，然后加入0.6%堿性蛋白酶，在60 ℃溫度下酶水解2 h，酶在水浴中冷卻至室溫，最后將濾液干燥，得到復合改性洋薊總膳食纖維。對改性后洋薊膳食纖維組分的粒徑、及紅外光譜圖進行分析。

1.3.3 小鼠肥胖模型的建立

選取50只BALB/c小鼠雌雄各半，先用基礎飼料適應性喂養1周，期間室溫控制在22～24 ℃，自由進食、飲水，12 h光照周期。1周后隨機分成5組，每組10只。取4組小鼠喂養高脂飼料進行肥胖模型的建立。剩余組作為空白對照組(CG)，飼養基礎飼料。高脂飼料喂養6周左右，直到模型組體重超過對照組體重的15%即為造模成功[15]。

1.3.4 小鼠的分組給藥及解剖

造模成功的小鼠進行編號分組，即高脂模型組(HF)、藥物陽性對照組(MC)、未改性洋薊膳食纖維飼喂組(ADF)以及低溫冷凍-超微粉碎洋薊膳食纖維飼喂組(LU-ADF)。其中HF組繼續飼喂高脂飼料，自由飲水，每天灌胃1次20mL/kg生理鹽水；MC組繼續飼喂高脂飼料，自由飲水，每天灌胃1次60 mg/kg奧利司他溶液；ADF組繼續飼喂高脂飼料，自由飲水，每天灌胃1次120 mg/kg未改性洋薊膳食纖維粉；LU-ADF組繼續飼喂高脂飼料，自由飲水，每天灌胃1次120 mg/kg低溫冷凍-超微粉碎洋薊膳食纖維粉[16]。連續灌胃4周后禁食不禁水12 h，稱體重和測血糖后取小鼠眼球血，分離血清測定血脂水平。全部小鼠脫臼處死迅速解剖，取肝臟，腹腔脂肪用冷生理鹽水漂洗，除去血水，稱重后用福爾馬林固定以待后期實驗數據的測定[17]。

1.3.5 小鼠血清中總膽固醇值、甘油三酯值的測定

將采集到的小鼠眼球血放入采血管內后靜置，等血清自然析出后，1 500 r/min，離心8 min，取上清液于EP管中待測，采用酶標儀比色法檢測其中總膽固醇值、甘油三酯值的含量[18]。

1.3.6 小鼠肝臟及脂肪組織切片染色觀察

將小鼠肝臟及脂肪組織用福爾馬林固定48 h，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，透蠟，包埋，脫蠟切片，蘇木精-伊紅(HE染色)，掃描儀觀察肝臟及脂肪組織結構[19]。

1.3.7 數據處理與統計分析

所有實驗平行3次，數據采用Microsoft Excel 2016進行處理，Origin2017作圖，結果均采用平均值±標準差的形式表示，通過SPSS 22.0進行分析數據，采用方差分析和t檢驗，P<0.05有顯著差異，P<0.01有極顯著差異。

2 結果與討論

2.1 各組洋薊膳食纖維基本成分分析

由表1可得出，經過低溫冷凍-超微粉碎處理的洋薊膳食纖維中可溶性膳食纖維組分明顯增多，不可溶性膳食纖維組分明顯降低，這可能是因為在改性過程中，不可溶性組分在冷凍和粉碎的過程中，更多的親水性基團暴露，導致可溶性組分增加。除了膳食纖維組分外，水分、蛋白、粗脂肪以及粗灰分的含量也發生了變化，推測可能是在檢測過程中存在誤差導致的，可忽略不計。

表1 洋薊膳食纖維成分表/g/100 g

2.2 洋薊膳食纖維粒徑、葡萄糖吸收能力以及紅外光譜分析

由圖1a分析可得隨著低溫冷凍時間的延長，低溫冷凍-超微粉碎復合改性的方法可使洋薊膳食纖維的粒徑分布更加均勻和集中；未進行低溫冷凍處理的洋薊膳食纖維，其粒徑分布較不均勻，雖然有部分粒徑較低，但總體分布上仍然存在較多粒徑過大的顆粒。這是由于洋薊膳食纖維進行低溫冷凍處理后，其本身的脆性增加，韌性降低，在超微粉碎時更容易被粉碎。

圖1 復合改性前后洋薊膳食纖維粒徑及紅外光譜分析圖

2.3 洋薊膳食纖維對小鼠體重的影響

注：CG：空白對照組、HF:高脂模型組、MC：藥物陽性對照組、ADF：未改性洋薊膳食纖維飼喂組、LU-ADF：低溫冷凍-超微粉碎洋薊膳食纖維飼喂組。圖2 洋薊膳食纖維對小鼠體重的影響

由圖2可以看出造模期間，CG組體重增長明顯低于其他實驗組，其余幾組增長趨勢一致。第7周開始進入給藥期，CG組和HF組在第1周略有下降后依舊保持上升趨勢；灌胃陽性藥物和膳食纖維的小鼠體重均開始下降，在第13周藥物組體重下降到低于CG組，LU-ADF組也接近CG組的體重，ADF組小鼠體重仍然高于CG組，但相比于HF組也顯著降低[21]。王學敏等在燕麥纖維對小鼠的潤腸通便功能研究中發現，適當劑量的燕麥纖維干預能夠有效的對小鼠的腸道起到潤腸通便的作用[22]，實驗組中采用燕麥纖維干預的小鼠體重均呈下降趨勢，與本研究基本一致。

2.4 洋薊膳食纖維對小鼠血糖的影響

圖3可以看出HF組和MC組血糖顯著升高，MC組雖然對體重降低很有幫助但是對血糖的抑制效果不顯著。LU-ADF組相對于ADF組其抑制血糖上升的能力較為顯著[23]。這是因為在溶液中有較大粘性的SDF能將葡萄糖分子包裹在其中，從而降低人體對葡萄糖的吸收，且復合改性處理后的洋薊膳食纖維中的SDF含量顯著增加，有效提高樣品對葡萄糖吸附能力。蘇玉[24]在蒸汽爆破-超微粉碎對米糠膳食纖維改性的研究中發現，經過改性后的米糠膳食纖維具有更優秀的吸附小鼠腸道中的血糖，使小鼠達到降低血糖的目的，同時小鼠體重也有明顯降低，與本研究基本一致。

注：CG：空白對照組、HF:高脂模型組、MC：藥物陽性對照組、ADF：未改性洋薊膳食纖維飼喂組、LU-ADF：低溫冷凍-超微粉碎洋薊膳食纖維飼喂組；*表示與模型組相比的差異性(P<0.05)；△表示與空白組相比的差異性(P<0.05)。下同。圖3 小鼠血糖水平

2.5 洋薊膳食纖維對小鼠血脂值的影響

由圖4可以看出HF組總膽固醇和甘油三酯值最高，MC組測量結果均低于CG組，ADF組和LU-ADF組結果略高于CG組，并且均顯著低于HF組，雖然膳食纖維組的血脂水平未能達到CG對照組，但顯著降低了小鼠血清中總膽固醇值、甘油三酯值的濃度，說明膳食纖維對小鼠有一定的降血脂作用。盧宏科等[25]發現肝臟中的膽固醇經過代謝后變成膽酸，膽酸到達小腸消化脂肪，隨后膽酸被小腸吸收回肝臟轉變成膽固醇。這是由于膳食纖維在小腸中能形成膠狀物質將膽酸包圍，膽酸將不再被小腸壁吸收進入肝臟，而是通過消化道被排出體外。因此，肝臟只能通過吸收血液中的膽固醇來補充消耗的膽酸，從而降低血液中膽固醇的含量，與本研究基本一致。經過低溫冷凍-超微粉碎復合改性的膳食纖維暴露出更多的功能基團，使其吸附性能得到顯著提升，從而達到更好降低血脂的作用。張薇等[26]在谷物膳食纖維對脂代謝紊亂小鼠肝臟毒性影響的研究中發現，經過谷物膳食纖維干預的實驗組小鼠，其肝臟毒性得到明顯緩解，小鼠血脂明顯低于模型組，與本研究基本一致。

圖4 小鼠血脂水平

2.6 洋薊膳食纖維對小鼠腹腔脂肪的影響

圖5為小鼠腹腔脂肪形態學切片，可看出HF組小鼠腹部大網膜脂肪體積明顯大于其他組，脂肪細胞膜不完整，炎性細胞增多。CG組小鼠腹腔脂肪大小均勻，排列緊密，脂肪組織的細胞間質很少，可見少量炎性細胞浸潤；MC組和LU-ADF組對比HF組均有顯著的改善，未見細胞膜破損和大量炎性細胞浸潤，表現接近CG組小鼠腹腔脂肪，ADF組細胞大小偏大，但組合相比HF組更有序。申瑞玲等[27]在其研究中指出，在短期內燕麥水不溶性膳食纖維會達到更好的減肥作用，但是長期來看，可溶性膳食纖維能夠更好地降低小鼠肝臟指數、總膽固醇值和甘油三酯值水平，促進肝酯酶和脂蛋白酶活性有效調節肝臟代謝紊亂。本研究中，經過低溫冷凍-超微粉碎復合改性的洋薊膳食纖維在LU-ADF組的實驗結果中表現優異，由于其含有較多的可溶性洋薊膳食纖維組分，對于肝臟的保護顯著優于未經過復合改性的洋薊膳食纖維。

注：A為HF：高脂模型組；B為MC：藥物陽性對照組；C為CG：空白對照組；D為ADF：未改性洋薊膳食纖維飼喂組；E為LU-ADF：低溫冷凍-超微粉碎洋薊膳食纖維飼喂組。下同。圖5 小鼠腹腔脂肪切片

圖6 小鼠肝臟組織切片

2.7 洋薊膳食纖維對小鼠肝臟的影響

各組小鼠肝臟組織切片如圖6所示。HF組小鼠肝臟細胞腫脹，排列雜亂無序，細胞周圍彌漫分布的微脂滴，可見肝細胞氣球樣變(肝細胞受損后水分增多引起脹大、胞漿疏松化，進一步發展肝細胞脹大如球形，胞漿幾乎透明、淡染)，與張君等[28]在研究肥胖、2型糖尿病過程中大鼠肝臟形態結構變化中對大鼠肝臟進行切片包埋鏡檢得到的結果相同。CG組小鼠肝臟結構有序、細胞著色均勻，未見脂肪空泡，說明基礎飼料對小鼠的生長無不良影響；與HF組相比LU-ADF組與ADF組小鼠肝臟病變情況均有好轉，但LU-ADF組對于預防肝臟病變的效果更佳明顯，細胞排列整齊，ADF組仍有有少量白色脂滴；本實驗觀察到的HF組小鼠肝臟細胞腫大，脂肪滴堆積可能是因為過量攝入高脂飼料超出肝臟可承受的范圍，而導致肝臟代謝紊亂，肝內脂肪發生蓄積，引起脂肪肝。洋薊膳食纖維能緩解肥胖引起的肝損傷，且能減輕肝臟腫大和脂肪肝的原因可能是由于其具有一定的降血脂的作用，從而調節肝臟脂代謝，改善肥胖小鼠脂肪肝的癥狀。

3 結論

利用低溫冷凍-超微粉碎復合改性洋薊膳食纖維干預肥胖小鼠，通過對小鼠的各項生理指標的測定，研究洋薊膳食纖維對肥胖小鼠的影響。復合改性洋薊膳食纖維能顯著改善小鼠肥胖的典型特征，小鼠實驗證明在復合改性洋薊膳食纖維的干預下，小鼠的體重、脂肪濕重、血糖、血脂水平顯著下降，對小鼠腹腔脂肪進行病理切片觀察可以看出復合改性洋薊膳食纖維對高脂飲食帶來的肝臟病變有良好的預防和改善作用。本研究僅在洋薊膳食纖維的層面上研究其對小鼠減肥的作用機制，今后需要從洋薊膳食纖維中分離出具體發揮減肥作用的物質，探索膳食纖維發揮減肥的作用機制。