阿魏酸通過調控JAK2/STAT6免疫信號通路抑制肺癌細胞增殖和轉移①

郭風 趙瑞敏 李景亮 劉源溪 楊淑娟（禹州市中醫院腫瘤內科，禹州 461670）

目前，肺癌在我國處于高發狀態，且發病率逐年上升［1］。作為一個全球醫療領域的研究熱點問題，目前針對肺癌的研究已有很多，但對肺癌治療有效的藥物仍然很少［2］。肺癌發生的分子機制十分復雜，致病因素多樣，導致其具有較高發病率［3］。國內外對肺癌的藥物研發已有很多，但阿魏酸作為傳統中藥阿魏和川芎的提取物［4］，其對肺癌的作用研究相對較少。目前有研究表明，傳統中藥阿魏（feru-lic acid，FA）和川芎具有很好的抑癌作用［5］，但是具體的抑癌成分尚不十分清楚，阿魏酸作為阿魏和川芎的提取物在抑癌作用中起到什么作用，同樣沒有報道。因此本研究以阿魏酸為研究對象，觀察其對非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的作用，同時對其作用的分子機制做了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料A549細胞購自鄭州大學細胞庫；阿魏酸單體購自河南省食品藥品檢驗所；蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、細胞裂解液購自北京碧云天；結晶紫、高錳酸鉀、草酸、冰醋酸購自鄭州馬基森生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏試劑生物有限公司；DMEM培養液、胎牛血清、胰蛋白酶消化液、青 鏈 霉 素購 自HyClone；β‐actin/COX‐2、Sur-vivin、XIAP、p‐53抗體購自Abcam。

1.2 方法

1.2.1 CCK‐8增殖實驗A549細胞4×105個/孔鋪板，細胞密度達到80%左右，不同濃度阿魏酸處理48 h。結束后每孔加入20μl CCK‐8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。酶標儀450 nm檢測細胞CCK‐8混合液OD值進行活力分析。

1.2.2 qRT‐PCR A549細胞4×105個/孔直接鋪板，細胞密度達到80%左右，給予10 ng/ml TGF‐β1刺激24 h，隨后不同濃度阿魏酸給藥處理48 h，嚴格按照試劑盒說明步驟進行提取、定量、反轉錄和PCR反應。

1.2.3 Western blot A549細胞4×105個/孔直接鋪板，細胞密度達到80%左右，10 ng/ml TGF‐β1刺激24 h，20μmol/L姜黃素處理48 h。隨后消化細胞鋪至培養皿，細胞密度80%時收集細胞，裂解液（含有蛋白酶抑制劑）冰上裂解30 min后，4℃高速離心30 min后吸取上層蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。電泳結束后進行轉膜，隨后脫脂牛奶封閉，PBST清洗Ku70、CDK12和β‐actin一抗（抗體稀釋比均為1∶1 000），4℃過夜。第2天冷PBS清洗條帶3次，二抗孵育1 h，發光儀發光拍照。

1.2.4 ELⅠSA檢測免疫炎癥因子水平A549細胞4×105個/孔直接鋪板，細胞密度達到80%左右，給予不同濃度阿魏酸處理48 h。采集細胞培養液，3 000 r/min離心20 min，離心分離后取上清液進行檢測。嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測細胞培養液IL‐4、PDGF和GM‐CSF的含量。

1.2.5 細胞劃痕實驗A549細胞4×105個/孔鋪板，細胞密度達到80%左右，劃痕處理，顯微鏡下觀察拍照，給予不同濃度阿魏酸處理48 h，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 細胞侵襲實驗A549細胞4×105個/孔鋪板，細胞密度達到80%左右，Transwell小室上室無血清DMEM接種A549細胞，下室10%血清DMEM。給予不同濃度阿魏酸處理48 h。多聚甲醛固定10 min，結晶紫室溫染色15 min，33%乙酸脫色。酶標儀570 nm檢測混合液OD值并進行分析。

1.3 統計學分析所有數據均經SPSS20.0軟件統計分析，計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗，多組間比較用F檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度阿魏酸對A549細胞增殖的抑制作用CCK‐8檢測不同濃度阿魏酸（0、0.5、1、2、4、8、16 mg/ml）給藥處理后的A549細胞活力，結果顯示不同濃度阿魏酸對A549的增殖具有抑制作用，且呈劑量依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 阿魏酸抑制A549細胞遷移能力2、4、8 mg/ml阿魏酸給藥處理A549細胞，48 h后觀察A549細胞劃痕愈合情況。結果表明，2、4、8 mg/ml阿魏酸作用A549細胞48 h后均能顯著抑制A549細胞劃痕愈合能力，且呈劑量依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 阿魏酸抑制A549細胞侵襲能力2、4、8 mg/ml阿魏酸給藥處理A549細胞，48 h后觀察A549細胞侵襲情況。結果表明2、4、8 mg/ml阿魏酸作用A549細胞48 h后均能顯著抑制A549細胞侵襲，且呈劑量依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖1 不同濃度阿魏酸對A549細胞增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of ferulic acid at different concen-trations on A549 cell proliferation

圖2 不同濃度阿魏酸對A549細胞遷移抑制作用Fig.2 Different concentrations of ferulic acid on migra-tion inhibition of A549 cells

圖3 不同濃度阿魏酸對A549細胞侵襲抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of ferulic acid at different concen-trations on A549 cell invasion

圖4 不同濃度阿魏酸抑制A549細胞腫瘤相關免疫表達Fig.4 Different concentrations of ferulic acid inhibit tu-mor‐associated immune expression in A549 cells

圖5 阿魏酸抑制A549細胞JAK2/STAT6免疫信號通路激活Fig.5 Ferulic acid inhibitis activation of JAK2/STA6 im-mune sigaling pathway in A549 cells

2.4 阿魏酸抑制A549細胞腫瘤相關免疫因子表達2、4、8 mg/ml阿魏酸給藥處理A549細胞，48 h后觀察A549細胞培養液中腫瘤相關免疫因子IL‐PDGF和GM‐CSF的表達情況。結果表明2、4、8 mg/ml阿魏酸作用A549細胞48 h后均能顯著抑制A549細胞培養液中腫瘤相關免疫因子IL‐4、PDGF和GM‐CSF的表達，且呈劑量依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.5 阿魏酸抑制A549細胞JAK2/STAT6免疫信號通路激活2、4、8 mg/ml阿魏酸給藥處理A549細胞，48 h后觀察A549細胞JAK2和STAT6的磷酸化以及p53、COX‐2、Survivin和XIAP的表達變化。結果表明2、4、8 mg/ml阿魏酸均能抑制JAK2和STAT6的磷酸化，上調p53的mRNA和蛋白表達，下調COX‐2、Survivin和XIAP的mRNA和蛋白表達，且呈劑量依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

肺癌已經成為影響人類健康的主要腫瘤疾病之一［1］。因其惡性程度高，發病的隱匿性以及難治愈性，已經成為腫瘤治療領域的研究熱點和臨床迫切需要解決的問題［6］。免疫信號通路的激活是肺癌細胞抗凋亡和發生腫瘤逃逸的主要原因［7‐8］，因此針對免疫信號的研究為非小細胞肺癌的治療提供新的思路和策略。

順鉑和紫衫醇在非小細胞肺癌的藥物治療中運用較成熟，但是其有較強的副作用，對患者術后恢復和生活造成嚴重影響［9］。阿魏酸來源于傘形科植物阿魏和川芎的根莖，具有抗血小板聚集、抑制血小板5‐羥色胺釋放、抑制血小板血栓素A2（TXA2）的生成、增強前列腺素活性、鎮痛、緩解血管痙攣等作用［10］。近些年有少量研究指出阿魏酸具有一定的抗腫瘤作用［11］，但沒有具體深入的機制研究，特別是涉及腫瘤免疫信號通路。因此本研究主要探討阿魏酸在體外對非小細胞肺癌增殖、遷移和侵襲的作用及其可能的作用機制。

腫瘤細胞的快速和無限增殖是腫瘤惡化的基礎，本研究首先觀察不同濃度阿魏酸對非小細胞肺癌A549細胞增殖的作用，結果發現阿魏酸能夠有效抑制A549細胞體外增殖，并且呈劑量依賴性。為了進一步觀察在其他實驗中阿魏酸是否同樣呈現劑量依賴性，后續實驗中選擇2、4、8 mg/ml 3個濃度作為給藥濃度。遷移和侵襲實驗是模擬驗證腫瘤細胞在體內的轉移能力，這為研究阿魏酸在體內對非小肺癌細胞的轉移作用奠定體外研究基礎。有研究證明JAK2/STAT6在多種腫瘤逃逸過程中扮演重要角色，作為一條經典的腫瘤免疫信號通路，JAK2/STAT6可以通過磷酸化激活下游COX‐2、Survivin和XIAP的表達，且抑制P53的表達［12］。本研究用不同濃度阿魏酸給藥處理A549細胞后，發現阿魏酸可以有效抑制JAK2/STAT6的磷酸化，同時觀察到下游的促癌基因COX‐2、Survivin和XIAP隨著阿魏酸濃度的增高而表達降低，P53表達則與之相反，說明阿魏酸可以有效抑制JAK2/STAT6腫瘤免疫信號通路的激活。

綜上所述，體外細胞實驗均證實阿魏酸可以抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲，而這些抑制作用很可能是通過抑制腫瘤免疫信號通路JAK2/STAT6的激活來實現的。但是阿魏酸在體內是否可以發揮同樣的作用，這是下一步的研究內容。