重樓皂苷Ⅶ下調S100A8抑制肺癌轉移前微環境形成①

羅斌 姚望 闕祖俊 于盼 羅添樂 田建輝

（上海中醫藥大學附屬龍華醫院腫瘤科，上海 200032）

癌癥是全球非傳染性疾病的第2大死亡疾病，其中肺癌死亡人數占據第1位［1］。美國肺癌年死亡約13.6萬，中國肺癌年死亡人數約63萬，其中約90%與轉移相關［2‐3］。因此，研發治療轉移的新藥具有重要的臨床價值。轉移前微環境（pre‐metastatic niche，PMN）是肺癌轉移的關鍵步驟，揭示PMN形成的分子機制，將有助于闡明轉移發生的機制，發現新的干預靶點［4］。免疫抑制是PMN的首要特征，研究證實髓源性抑制細胞（myeloid‐derived suppres-sor cells，MDSCs）介導的免疫抑制在PMN形成過程中發揮重要作用［5‐6］。MDSCs通過分泌精氨酸酶‐1（arginase1，Arg‐1）、吲哚胺2，3‐雙加氧酶（indole-amine 2，3‐dioxygenase，IDO）、活性氧簇（reactive ox-ygen species，ROS）等介導免疫抑制，誘導肺臟區域免疫紊亂。本課題組前期研究也證實MDSCs在非小細胞肺癌（non‐small cell lung cancer，NSCLC）患者的外周血中高表達，并與NSCLC的臨床分期相關，同時研究發現肺積方（生黃芪、北沙參、石見穿、重樓等）具有下調腫瘤微環境中IDO表達，改善局部免疫抑制的作用［7‐8］。為了深入探索MDSCs介導的區域免疫抑制在誘導PMN形成過程中的作用機制，以及中醫藥對PMN的調節作用，本實驗從MD-SCs介導的肺臟區域免疫紊亂促進PMN形成的角度，揭示中藥重樓的有效單體重樓皂苷Ⅶ干預PMN形成的機制，以初步探索惡性腫瘤轉移的局部“正虛”科學內涵。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠2LL‐GFP/Luc細胞購自中國生命科學院上海細胞庫；5～6周齡的C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，在上海中醫藥大學動物實驗中心飼養；DMEM培養基、胎牛血清、青霉素‐鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；重樓皂苷Ⅶ購自四川省維克奇生物科技有限公司（貨號：C11007228）；紫杉醇購自海口市制藥廠有限公司（國 藥 準 字H10980170）；CD11b（APC）/Ly‐6G（FITC）/Ly‐6C（PE）流式抗體購自達科為生物技術股份有限公司；免疫組化抗體IDO/Arg‐1/ROS/S100A8/S100A9購自CST公司；免疫組化試劑盒購自福建邁新生物科技有限公司；全自動多色分析流式細胞儀系統（FACSVerse）及紅細胞裂解液購自美國BD公司；熒光倒置顯微鏡（DMI3000B）購自德國萊卡公司；小動物活體成像儀（LB983 NC320）購自德國Berthold Technologies GmbH&Co.KG公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及干預方法將懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養基中的小鼠2LL‐GFP/Luc細胞放在37℃、濕度40%、5%CO2的條件下培養，待細胞達到對數期時，采用細胞計數儀進行計數，然后消化備用。將實驗用C57BL/6小鼠（體重20±2 g）按體重隨機分組的方法分為生理鹽水對照組（NS）、重樓皂苷Ⅶ組（PP7）、紫杉醇組（PTX）、重樓皂苷Ⅶ+紫杉醇聯合組（PP7+PTX），每組8只；在超凈臺中，在小鼠右側腋下（去毛備皮）注射準備好的細胞懸液（2×105個/只），建立小鼠皮下移植瘤模型。完成建模后第1天，按照計算用量及組別，分別給予紫杉醇［15 mg/(kg·d)，每隔3 d給藥1次，腹腔注射］和重樓皂苷Ⅶ［10 mg/(kg·d)，給藥方式同紫杉醇］。

從造模第一天開始每3 d做1次小鼠活體成像實驗，檢測小鼠成瘤情況及肺臟轉移情況，并記錄皮下瘤長寬徑，待第18天采用麻醉后先采靜脈血，后頸椎脫臼法處死小鼠，取瘤體稱重并留取檢測樣本。

1.2.2 流式細胞術檢測方法取100μl靜脈血樣本置于標記好的流式上樣管，加入5 μl的Fc阻斷劑，避光室溫孵育5 min；在上樣管中分別加入抗體CD11b（APC）/Ly‐6G（FITC）/Ly‐6C（PE）各5 μl，避光孵育15 min；每個上樣管中加入紅細胞裂解液3 ml，避光孵育6～8 min，至澄清時離心（1 500 r/min，5 min）；棄上清，重復上述離心步驟2次，棄上清，加入生理鹽水300μl，在混懸儀器上混勻，上機檢測。

1.2.3 免疫組化檢測方法將組織石蠟包埋切片；烤片：將切好的切片置于70℃烤箱內烤片2 h；脫蠟水化：按照順序依次以二甲苯10 min×3次、無水乙醇10 min、95%乙醇10 min、85%乙醇10 min、75%乙醇10 min，后自來水沖洗5 min；抗原修復：配置EDTA抗原修復溶液5 ml，微波中火加熱至沸騰約需210 s，然后將病理切片緩慢放入沸騰的修復液內，微波修復20 min，自然冷卻，PBS沖洗3 min×3；封閉內源性過氧化物酶：滴加H2O2溶液（試劑A），室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3；抗原封閉：滴加動物非免疫動物血清（試劑B），室溫下孵育10 min；結合抗體：除去多余血清，每張切片加抗體1滴（1∶200），4℃過夜，PBS沖洗3 min×3。滴加生物素標記的第二抗體（試劑C），室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3。滴加鏈霉素抗生物蛋白（試劑D），室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3。配備DAB溶液2 ml（A 2 ml、B 2滴、C 2滴），每張切片加100 μl新鮮配制的DAB溶液，肉眼觀察直至變黃，約3～5 min。自來水沖洗2 min，蘇木素襯染3 min，自來水沖洗5 min，PBS返藍2 min。透明，烘干，中性樹膠封片，鏡下掃描讀片，并采用Image J軟件對掃描的結果進行定量分析。

1.3 統計學方法采用Graphpad Prism 8.0軟件對數據進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 重樓皂苷Ⅶ抑制模型皮下腫瘤增殖采用活體成像技術檢測小鼠肺臟轉移灶形成情況（圖1），采用HE染色檢測留取的小鼠肺臟組織樣本，發現PP7組的1只小鼠肺臟出現明顯的轉移灶（圖2E），同時，結果顯示瘤體積在對照組與PP7+PTX組之間具有顯著性差異（圖2C）。與對照組相比，瘤重在PP7組、PP7+PTX組之間具有顯著性差異，紫杉醇組無顯著性差異（圖2B），各組之間的小鼠體重之間無顯著性差異（圖2D）。

2.2 外周血MDSC的表達比例本實驗以流式細胞術檢測皮下瘤移植模型小鼠外周血中的MDSCs的比例，以CD11b、Ly‐6G、Ly‐6C為標志，結果發現各組的外周血中M‐MDSCs與PMN‐MDSCs無統計學意義（圖3）。

2.3 肺臟微環境中MDSCs發揮免疫抑制因子檢測為了進一步證實MDSCs發揮免疫抑制促進局部免疫環境紊亂，檢測了MDSCs發揮免疫抑制作用的蛋白IDO、ROS、Arg‐1在肺臟組織的表達情況。結果發現，與對照組比較，聯合組的Arg‐1表達水平明顯下調，而IDO的表達水平，各組均下調；與紫杉醇組比較，聯合組及PP7組未見明顯差異；ROS在各組之間無顯著性差異（圖4）。

圖1 造模后第12天的小鼠活體成像檢測Fig.1 In vivo imaging of mice on the 12th day after mod-eling

2.4 MDSCs誘導肺臟局部免疫紊亂促進轉移前微環境形成采用免疫組化檢測了肺臟中S100A8/S1000A9蛋白的表達，結果發現，與對照組比較，紫杉醇、PP7及聯合組均可以下調S100A8的表達，而各組之間S100A9表達水平無統計學意義（圖5）。

圖2 重樓皂苷Ⅶ抑制皮下腫瘤增殖Fig.2 PolyphyllinⅦinhibits subcutaneous tumor prolif-eration

圖3 流式細胞術檢測各組模型外周血中MDSC不同亞群的比例Fig.3 Flow cytometry was used to detect the proportion of MDSC subgroups in peripheral blood of each group

圖4 各組小鼠肺臟中MDSCs分泌的免疫抑制蛋白表達水平Fig.4 Expressions level of immunosuppressive protein se-creted by MDSCs in lung of each group

圖5 肺臟組織S100A8/S1000A9表達與PMN形成Fig.5 Expressions of S100A8/9 and PMN formation in lung tissue

3 討論

轉移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因，有研究顯示NSCLC轉移的主要部位發生率是大腦（12%～47%）、骨（16%～39%）、肝臟（7%～22%）、肺內（對側或同側肺葉，11%～26%）、胸膜（10%～13%）、胸腔淋巴結（29%）和腎上腺（6%～15%）［8］。而轉移發生的主要步驟是原發灶的免疫逃逸、外周循環生存、靶器官的定植與增殖，針對原發灶的腫瘤微環境，目前免疫治療制劑已經進入臨床應用，而外周血中主要是循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC），但是由于外周血成分復雜而且CTC缺乏明確的生物學標記，因此靶向外周的治療手段存在較大的技術瓶頸［9‐10］。所以，阻止轉移靶器官環境形成是預防轉移發生的一個重要策略，本研究發現重樓的有效單體重樓皂苷Ⅶ通過下調皮下移植瘤模型肺臟S100A8表達抑制PMN形成預防肺轉移，其機制可能是干預MDSCs的免疫抑制作用，初步揭示了扶正中藥預防肺癌細胞轉移的可能機制，為中醫藥臨床應用提供依據。

PMN的形成是肺癌細胞轉移的必要環節，研究發現PMN的主要特征是免疫抑制［11］。在PMN形成過程中，腫瘤原發灶分泌的外泌體（含蛋白、RNA、DNA等）、調節性T細胞、免疫細胞因子、血管內皮生長因子、MDSCs等均發揮了重要作用［5，12‐14］。而MD-SCs作為PMN形成過程中的重要因素近年來備受學者關注［15］。MDSCs是一群具有免疫抑制作用的骨髓來源異常分化細胞，主要分為2個亞群：單核系MDSC（M‐MDSCs）和 多 核 系MDSCs（PMN‐MD-SCs）［16］。研究發現臨床中肺癌患者外周血中的MD-SCs表達比例與其臨床分期具有密切相關性［6］。而Lewis肺癌細胞培養上清具有激活MDSCs糖酵解途徑，促進其抑制T細胞的功能，MDSCs以IDO、ROS、Arg‐1、S100A8/9等 多 途徑 介導 機 體免 疫紊亂 是PMN形成 的重 要因 素［17，11］。肺 臟 組織 中S100A8/S1000A9/MMP9/Fn/Bv8的表達變化是PMN形成的重要指標［11，18］。而S100A8/S1000A9是MDSC分泌的免疫炎性蛋白，是促進肺臟局部免疫紊亂的重要因素［19‐20］。本研究發現外周循環MDSCs的不同亞群比例在各組之間無差異，但肺臟中MDSCs發揮免疫抑制作用的IDO、Arg‐1在對照組與各組之間存在差異，其原因可能是干預手段對外周循環的MDSCs無顯著影響，但是對肺臟MDSCs的招募及免疫抑制功能的活化可能發揮作用。另外，有研究發現S100A8/9在調節髓系細胞免疫功能方面發揮重要作用［21］。而LIU等［22］亦發現在肺癌PMN形成過程中S100A8/9、MMP9等過表達。呂彥天等［23］發現S100A8蛋白在NSCLC組織中明顯高于癌旁組織，隨病理分期增高及腫瘤分化程度降低，S100A8蛋白表達陽性率增高，而且研究證實MDSCs分泌S100A8/9發揮免疫抑制作用，同時S100A8高表達對MDSCs局部累積有募集作用［6，24］。因此S100A8在腫瘤模型的肺臟組織中高表達可能促進MDSCs的招募并活化MDSCs的免疫抑制作用，促進有利于CTC定植的肺臟PMN形成，形成臨床微轉移。本研究發現重樓皂苷Ⅶ具有下調S100A8作用，故初步揭示了中醫藥干預PMN形成預防轉移的分子機制是下調肺臟S100A8水平，但是具體機制仍待進一步研究。有研究發現S100A8可激活MAPK途徑和NF‐κB信號通路促進腫瘤細胞的增殖［6］。因此課題組未來將從抑制PMN形成與腫瘤細胞增殖角度出發，深入研究中醫藥干預S100A8表達預防轉移的分子機制。

轉移是惡性腫瘤治療失敗的主要原因，而目前尚無具有明確療效的針對轉移預防的藥物，其原因主要是以下3點：一是轉移具體機制尚未闡明，缺乏成熟的理論指導；二是目前腫瘤轉移防治藥物的開發多以原發灶腫瘤細胞為基礎，而建立有效的具有轉移潛能的細胞系可能是重要方向；三是對轉移發生靶器官的認識不足，尤其是腫瘤細胞是如何選擇生存的靶器官。在“扶正治癌”學術思想指導下，田建輝結合中醫學、腫瘤學、免疫學等學科交叉的國內外研究進展，提出肺癌轉移的“正虛伏毒”核心病機，認為“伏毒”是以CTC、腫瘤干細胞、休眠腫瘤細胞等為代表的潛伏因素，而“正虛”則是以免疫衰老、免疫逃逸、神經‐內分泌‐免疫紊亂等為代表［24‐25］。課題組已率先建立了人肺腺癌CTC系（CTC‐TJH‐01），構建了轉移研究的藥物篩選平臺，基于CTC‐TJH‐01建立的轉移研究平臺，課題組初步揭示了扶正中藥的防治轉移的機制［26］。PMN的形成是臟腑局部免疫抑制導致的“正氣虧虛”，既往研究顯示重樓皂苷Ⅶ主要是抑制腫瘤細胞的增殖、促進其凋亡等［27］。本研究發現重樓皂苷Ⅶ能抑制PMN形成，提示其可能具有“扶正”的作用，這初步證實中藥多組分、多途徑、多靶點作用機制在臨床中的不同價值，將為未來篩選轉移防治藥物提供新思路。

PMN作為CTC進入靶器官定植的關鍵條件，為其生存、增殖提供了有利環境。肺癌術后患者在臨床中缺乏明確的癥狀或體征，尤其是早期患者（Ⅰa期）西醫認為屬于治愈，術后不需要任何的干預，僅定期隨訪即可。PMN的形成是靶器官局部的微觀變化，現代醫學缺乏有效手段以直接觀察，因此易被忽視。中醫古籍《黃帝內經》曰“邪之所湊，其氣必虛”，因此術后靶器官的PMN形成可能是臟腑局部“正虛”的表現，局部的“正氣虧虛”形成適宜“伏毒（循環腫瘤細胞等）”生存的環境，隨著正氣的進一步虧耗，最終形成微轉移。中醫學歷來重視“治未病”的思想，而干預PMN形成阻止CTC的定植，可能是扶正中藥預防惡性腫瘤轉移的關鍵途徑，本研究對中藥單體在抑制PMN形成的作用進行了探索，這可能為未來研究中醫藥預防轉移的臨床應用提供新的策略。