樺褐孔菌多糖通過NLRP3/NF‐κB信號通路對結腸炎相關結直腸癌小鼠的影響①

李佳威 曲超陳一方 鄭金娟 肖瑤 黃學洙 金丹 李芳芳

（延邊大學醫學院免疫學與病原生物學教研室，延吉 133002）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全世界范圍內癌癥死亡的關鍵原因之一［1］。由于飲食習慣的改變、經濟發展的進步及生活質量的提高，CRC的發病率逐年上升。結腸炎相關結直腸癌（colitis‐as-sociated colorectal cancer，CAC）通常在患有長期腸道炎癥的患者如炎癥性腸病（inflammatory bowel dis-ease，IBD）患者中發展，且其腫瘤可能在體內其他部位形成。CAC是IBD的主要并發癥，其發病率和死亡率呈逐年遞增趨勢［2］。目前關于慢性炎癥性疾病和癌癥之間的關聯（包括有關IBD演變為CAC的各種理論）尚不明確。

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種名貴的藥用真菌，具有多種活性物質，包括樺褐孔菌多糖、樺褐孔菌醇、超氧化物歧化酵素、氧化三萜類以及樺褐孔菌素和葉酸衍生物等多種化合物［3‐5］。其中以樺褐孔菌中多糖（Inonotus obliquuspolysaccharide，IOP）的研究最為深入。據報道，IOP在多種癌癥中發揮抗腫瘤作用，且具有多層次、多靶點等作用［6‐8］。還有研究表明，IOP可通過NF‐κB或NLRP3信號通路預防腫瘤的發生發展，如肝癌，黑色素瘤等，但對于CRC的研究較為少見［9‐10］。課題組前期實驗表明，IOP對DSS誘導的小鼠結腸炎具有抑制作用，但對于CAC的作用尚不明確［11］。基于以上研究，課題組提 出IOP通過 影響NF‐κB和NLRP3通 路 干 預CAC的發生發展的可能性。因此，本研究通過SW620細胞株及建立AOM/DSS誘導的CAC小鼠模型，初步研究IOP在CAC中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞及動物人結直腸癌細胞SW620購自中國科學院上海細胞庫。6～8周齡BALB/c雄性小鼠購自億斯實驗動物技術有限公司，飼養于本校實驗動物中心，飼養溫度：（22±2）℃，濕度：40%～60%。本實驗符合延邊大學動物實驗管理委員會相關規定。

1.1.2 主要試劑樺褐孔菌由本校藥學院天然藥物化學教研室鑒定，IOP由延邊大學免疫生物學重點實驗室提取；氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）購自Sigma公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）購自MP公司；DMEM培養基購自BI公司；TRIzol購自Invitrogen公司；M‐MLV，Oligo（dt）購自Promega公 司；rTaq購 自TaKaRa公 司；ASC、NF‐κBp65、Cleaved Caspase‐3、β‐actin抗體購自CST公司；NL-RP3、Caspase‐1、Bax、Bcl‐2抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養將SW620細胞置于DMEM培養基，于37℃、5%CO2的恒溫箱中培養48 h。

1.2.2 小 鼠CAC模 型 的 建 立6～8周 齡 雄 性BALB/c小鼠隨機分為正常組、模型組（AOM/DSS）和IOP組（150 mg/kg·d）。模型組和IOP組腹腔內單次注射10 mg/kg AOM，1周后，將含2.5%DSS（w/v）的飲用水給小鼠飲用1周，隨后換成新鮮飲用水飲用2周，以每給予1周DSS和2周新鮮飲用水為1個周期，重復循環4次。IOP組隔天灌胃給予IOP溶液。在第101天建模結束后處死全部小鼠，并收集小鼠結腸及血液。

1.2.3 小鼠結腸組織的病理學檢測 取小鼠結腸組織固定于4%甲醛溶液，并制成厚度為4μm的石蠟切片，HE染色觀察小鼠結腸組織病理變化。評分標準見表1。

表1 病理學評分標準Tab.1 Pathological scoring standard

1.2.4 CCK‐8法檢測細胞增殖細胞1×104個/孔接種于96孔板，加入不同濃度的IOP（0、50、100、150μg/ml）培養48 h，以10μl/孔加入CCK‐8溶液，孵育2 h后檢測細胞增殖。

1.2.5 RT‐PCR檢測基因表達以TRIzol法提取組織和細胞中的總RNA，取1 μl樣品檢測RNA質量，OD260/OD280在1.8～2.0之間可進行后續實驗。使用M‐MLV及Oligo（dt）進行反轉錄，合成cDNA。最后以rTaq及相關引物進行PCR擴增。PCR擴增條件為95℃6 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，72℃5 min。人源引物序列：NLRP3 F：5'‐TGGCTGTAA-CATTCGGAGATTG‐3'，R：5'‐GAAGTCACCGAGGGC-GTTGT‐3'；Caspase‐1 F：5'‐GGAAACAAAAGTCG-GCAGAG‐3'，R：5'‐ACGCTGTACCCCAGATTTTG‐3'；ASC F：5'‐GGTCACAAACGTTGAGTGGC‐3'，R：5'‐AGAGCTTCCGCATCTTGCTT‐3'；GAPDH F：5'‐CCA-CATCGCTCAGACACCAT‐3'，R：5'‐GCAACAATATAC-CACTTTACCA‐3'，鼠 源 引 物 序 列：NLRP3 F：5'‐GAGTTCTTCGCTGCTATGT‐3'，R：5'‐ACCTTCACGT‐CTCGGTTC‐3'，Caspase‐1 F：5'‐TATCCAGGAGG‐GAATATGTG‐3'；R：5'‐ACAACACCACTCCTTGTTTC‐3'；ASC F：5'‐ACACTTTGTGGACCAGCACA‐3'，R：5'‐CACGAACTGCCTGGTACTGT‐3'；IL‐6 F：5'‐ACATT-GTGGACCAGCACA‐3'，R：5'‐CACGAACTGCCGTAC‐TGT‐3'；TNF‐α F：5'‐GGCAGGTCTCTTTGGAGTCTG‐3'，R：5'‐ACATTCGAGGCTCCAGTCATCG‐3'；β‐actin F：5'‐TCTGGTCGTACCACAGGCAT‐3'，R：5'‐CGCTC-GTTGCCAATAGTGAT‐3'。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達裂解細胞和結腸組織，提取相關蛋白，BCA試劑盒測定蛋白質含量，蛋白質在8%～15%SDS‐PAGE凝膠上分離后，轉移至PVDF膜，將印跡與一抗孵育24 h，洗滌印跡，加入標記有HRP的山羊抗兔或抗鼠IgG孵育1 h，再次洗滌，加入ECL發光液進行顯影并成像。

1.3 統計學分析使用Graph Pad Prism 7進行統計學分析。所有數據均以±s表示，使用t檢驗進行組間比較，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ⅠOP可抑制SW620細胞增殖如表2所示，IOP可有效抑制SW620細胞增殖（P＜0.05），且表現出劑量依賴性。因此，選擇0、50、100、150 μg/ml 4個劑量進行后續實驗。

2.2 ⅠOP誘導SW620細胞凋亡如圖1所示，IOP可顯著增加Bax和Cleaved Caspase‐3表達，降低Bcl‐2表達，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。以上結果提示，IOP可誘導SW620細胞凋亡。

2.3 ⅠOP增加SW620細胞中NF‐κBp65磷酸化及NLRP3炎癥小體的水平如圖2所示，IOP可上調NLRP3炎癥小體達，增強腫瘤細胞中p‐p65表達。以上結果提示，IOP可通過激活NF‐κB和NLRP3炎癥小體表現出較強的抗腫瘤能力。

2.4 ⅠOP改善AOM/DSS誘導的小鼠CAC與模型組相比，IOP組小鼠體型明顯增大，背部毛發較光澤，豎毛現象明顯減少，且IOP組的小鼠體重明顯上調（表3）。此外，在整個建立模型的過程中，模型組小鼠生存率為41.67%，IOP組為66.67%，正常組無死亡情況。HE染色結果表明，與模型組比，IOP組小鼠出現較少的腫瘤性腺體及炎癥細胞浸潤，部分隱窩結構丟失，存在部分杯狀細胞（圖3）。以上結果提示，IOP可明顯緩解AOM/DSS誘導的小鼠CAC。

2.5 ⅠOP可緩解小鼠的結腸長度和結腸內腫瘤情況IOP治療后觀察各組小鼠結腸及腫瘤變化。與正常組相比，模型組小鼠結腸長度明顯降低；與模型組相比，IOP組呈增加趨勢（表4，P＜0.05）。此外，如表5所示，IOP可明顯下調結腸內腫瘤情況（腫瘤數量、腫瘤大小、腫瘤負荷）。以上結果提示，IOP可抑制CAC小鼠腫瘤的發生。

表2 SW620細胞增殖能力的比較(±s)Tab.2 Comparison of SW620 cell proliferation ability(±s)

表2 SW620細胞增殖能力的比較(±s)Tab.2 Comparison of SW620 cell proliferation ability(±s)

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with IOP low dose group，2）P＜0.05；compared with IOP middle dose group，3）P＜0.05.

Incubation time（48 h）100.00±3.18 87.50±9.561）77.92±8.831）69.66±2.951）2）3）Groups Control IOP low dose IOP middle dose IOP high dose Concentration（μg/ml）0 50 100 150

圖1 IOP誘導SW620細胞凋亡Fig.1 IOP induced SW620 cell apoptosis

圖2 IOP增加SW620細胞中NF‐κBp65磷酸化及NLRP3炎癥小體水平Fig.2 IOP increased levels of NF‐κBp65 phosphorylation and NLRP3 inflammasome in SW620 cells

2.6 ⅠOP可下調結腸組織中ⅠL‐6和TNF‐α表達如圖4所示，經IOP處理后，IL‐6和TNF‐α的基因和蛋白表達降低（P＜0.05或P＜0.01）。提示IOP可抑制CAC小鼠中炎癥介質的產生。

2.7 ⅠOP可上調結腸組織中NF‐κBp65磷酸化及ASC、Caspase‐1及NLRP3表達與正常組相比，模型組中ASC、Caspase‐1、NLRP3的基因和蛋白水平均升高，經IOP處理后，三者表達被進一步升高。此外，IOP可明顯增加p‐p65蛋白表達。以上結果提示，IOP可通過激活NF‐κB信號途徑進一步激活NL-RP3炎癥小體，從而預防CAC的發生發展（圖5，P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組小鼠體重比較(±s)Tab.3 Comparison of body weight of mice in each group(±s)

表3 各組小鼠體重比較(±s)Tab.3 Comparison of body weight of mice in each group(±s)

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

Groups Concentration（mg/kg）Number of animals（Start）Number of animals（End）Mice body weight（g）38.06±4.94 25.98±2.311）27.52±2.462）Control Model IOP 0 -5 150 12 12 5 5 8

表4 各組小鼠結腸長度的比較(±s)Tab.4 Comparison of colon length of mice in each group(±s)

表4 各組小鼠結腸長度的比較(±s)Tab.4 Comparison of colon length of mice in each group(±s)

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

Colon length（cm）9.867±0.57 7.600±0.351）8.400±0.352）Groups Concentration（mg/kg）Number of animals Control Model IOP 0 -150 5 5 8

圖4 IOP可下調結腸組織中IL‐6和TNF‐α表達Fig.4 IOP down‐regulated expression of IL‐6 and TNF‐α in colon tissues

圖5 IOP可上調結腸組織中NF‐κBp65磷酸化及ASC、Caspase‐1及NLRP3表達Fig.5 IOP up‐regulated phosphorylation of NF‐κBp65 and expression of ASC，Caspase‐1，NLRP3 in co-lon tissues

表5 各組小鼠結腸腺瘤的比較(±s)Tab.5 Comparison of mouse colonic adenomas in each group(±s)

表5 各組小鼠結腸腺瘤的比較(±s)Tab.5 Comparison of mouse colonic adenomas in each group(±s)

Note：Compared with model group，1）P＜0.05.

Tumor volume（mm3）59.09±8.27 24.99±6.481）Groups Model IOP Concentration（mg/kg）-150 Number of animals 5 8 Tumor number 24.5±3.32 14.0±3.091）Tumor load（mm）3.48±0.68 1.50±0.461）

3 討論

慢性炎癥引發癌變的過程十分復雜。在伴有IBD的CAC病例中，疾病的嚴重程度、病程和炎癥程度均與腫瘤的發展有關［12］。因此，IBD的有效治療在預防CAC的發展中起關鍵作用。目前，IBD已廣泛使用5‐氨基水楊酸、皮質類固醇、胍基嘌呤和TNF‐α阻滯劑治療［13‐14］。但這些藥物與CAC的發生發展之間的關系尚不明確。因此，迫切需要用于CAC的新型安全有效的藥物。

細胞無限增殖是腫瘤細胞最顯著的特點。大量文獻表明，中藥對惡性腫瘤細胞的增殖起到抑制作用。如姜黃素可抑制胃癌細胞的增殖和侵襲轉移、人參皂苷CK可誘導肝癌細胞凋亡，進而抑制細胞生長［15‐16］。也有研究表明，IOP可抑制肺癌細胞的活力和集落形成能力［17］。本研究發現，IOP可有效抑制SW620細胞增殖，且隨著濃度的增加，抑制作用明顯提高。此外，IOP還可改善AOM/DSS誘導的CAC小鼠結腸腫瘤的損害。說明IOP可通過抑制細胞增殖和結腸腫瘤的生長減輕CAC發展。

Bcl‐2家族的蛋白質是啟動細胞凋亡的關鍵調控基因，包括抗凋亡蛋白Bcl‐2和促凋亡蛋白Bax。Bcl‐2在多種腫瘤組織中表達，可通過增加線粒體膜電位并抑制線粒體鈣離子釋放啟動腫瘤細胞凋亡。Bax是受Bcl‐2調節的促凋亡蛋白，可誘導線粒體通透性發生變化、激活凋亡相關蛋白并釋放細胞色素［18］。本研究發現，SW620細胞經IOP處理后，凋亡蛋白Bcl‐2表達水平顯著降低，而Bax、Cleaved Cas-pase‐3蛋白表達明顯升高，說明IOP誘導SW620細胞發生凋亡。

NLRP3是炎癥小體NLRP家族主要的成員之一，當受到胞外刺激時，可使PYD結構域與ASC相結合并募集pro‐Caspase‐1，NLRP3炎癥小體形成后，加速pro‐Caspase‐1剪切為活化的Caspase‐1，進而將IL‐1β、IL‐18前 體 切 割 為IL‐1β、IL‐18釋 放 到 體外［19］。NLRP3在炎癥反應中起重要作用，NLRP3炎癥小體的激活與炎癥誘導的癌癥有關。然而，NL-RP3炎癥小體在IBD和CAC中的作用存在爭議。CHEN等［20］研究證明炎癥小體活性可通過調節腸道穩態和抗微生物免疫促進炎癥性疾病和CAC發生。BAUER等［21］也指出NLRP3的激活顯著提高IBD風險。然而，與之形成鮮明對比的是，其他研究表明NLRP3炎癥小體對結腸炎具有保護作用［22］。AL-LEN等［23］指出，在AOM/DSS處理的NLRP3、Cas-pase‐1和ASC缺失小鼠中，結腸腫瘤的大小大于同樣處理的野生型小鼠。ZAKI等［22］發現NLRP3的激活抑制AOM/DSS誘導的CAC，支持了NLRP3炎癥小體在阻止CAC發生方面的作用。與這些發現一致，本團隊發現IOP處理可明顯增加SW620細胞裂解液和小鼠結腸組織中NLRP3炎癥小體表達。說明IOP通過激活NLRP3炎癥小體保護小鼠免受AOM/DSS誘導的CAC的侵害。

NF‐κB是細胞中關鍵的轉錄調節因子，參與炎癥反應、免疫調節和細胞生存等多種生命過程［24］。NF‐κB復合物作為p50和p65亞基的二聚體存在于細胞質，p65亞基的磷酸化增強NF‐κB的轉錄活性，進而調控炎癥細胞因子的表達［25］。NF‐κB是炎癥細胞因子產生的主要調控因子，其對NLRP3炎癥小體的激活也很重要。既往研究表明NLRP3炎癥小體的激活受NF‐κB調控［26］。有研究表明，NLRP3表達增強可通過激活NF‐κB實現，表明NF‐κB與NLRP3炎癥小體表達呈正相關［27］。本研究發現IOP可增加p‐p65表達，說明IOP可激活CAC中NF‐κB信號通路表達。

IL‐6是一種多向性炎癥細胞因子，不僅在免疫和炎癥反應中起重要作用，而且是惡性腫瘤的重要生長因子。TNF‐α是TNF/TNFR細胞因子超家族的成員，參與促進和發展實驗性腫瘤和人類癌癥高源。等［28］發現，IL‐6可促進肺癌細胞的侵襲轉移，經漢黃芩素處理后可進一步抑制IL‐6誘導的細胞侵襲轉移。本研究發現IOP可減少IL‐6和TNF‐α產生。也就是說，即在基因水平上p‐p65作為轉錄因子轉錄的IL‐6和TNF‐α表達降低，說明IOP可能對p‐p65引起的IL‐6轉錄具有抑制作用。以上研究結果僅是對IOP抑制細胞因子（IL‐6和TNF‐α）表達的初步研究，其具體作用機制還有待進一步探討。

綜上所述，IOP改善AOM/DSS誘導的小鼠CAC，其主要機制可能是通過激活NF‐κB和NLRP3信號通路和調控細胞因子的表達抑制CAC的發生。IOP發揮出較強的抗腫瘤作用，為中藥在治療腫瘤方面奠定理論基礎。