基于能量代謝系統(tǒng)評價延胡索乙素對人肝癌細(xì)胞的影響①

尹遜哲 劉作家 郭焱（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型。HCC已成為全球第六大常見癌癥和第四大癌癥死亡原因，世界衛(wèi)生組織預(yù)計到2030年，全球?qū)⒂谐^一百萬人因HCC死亡［1］。雖然目前臨床的化療、放療等治療方法對HCC患者的治療效果顯著，但患者的5年生存率僅在14.1%左右［2］。由于HCC死亡率高、預(yù)后差，開發(fā)更有效的治療策略和藥物是當(dāng)務(wù)之急。延胡索乙素（tetra-hydropalmatine，THP）又稱四氫巴馬汀，是罌粟科紫堇屬植物延胡索的一種生物堿（屬于原小檗堿類生物堿），是中藥材延胡索的主要有效成分，目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)［3‐4］。線粒體是機體能量代謝、物質(zhì)合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞器，為多數(shù)真核細(xì)胞提供氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）產(chǎn)生的ATP［5］。與正常細(xì)胞主要依賴于OXPHOS不同，腫瘤細(xì)胞增殖不僅需要重要介質(zhì)——線粒體，還依賴有氧糖酵解，糖酵解的增加為腫瘤細(xì)胞快速增殖提供“合成材料”［6］。因此，了解腫瘤發(fā)生過程中藥物治療線粒體的機制將是下一代癌癥治療的關(guān)鍵。目前，延胡索乙素對人HCC SMMC‐7721細(xì)胞的能量代謝作用尚未闡明。本實驗通過THP調(diào)控SMMC‐7721細(xì)胞能量代謝影響OXPHOS和糖酵解的能量代謝表型，實現(xiàn)THP對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，以期為HCC的治療與基礎(chǔ)研究提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料延胡索乙素購自北京索萊寶生物公司；人HCC細(xì)胞株SMMC‐7721購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK‐8細(xì)胞活力試劑盒購自日本同仁公司；Seahorse XFp體外細(xì)胞能量代謝分析系統(tǒng)、細(xì)胞線粒體壓力測試試劑盒、糖酵解壓力測試試劑盒、Cali-brant校準(zhǔn)液、細(xì)胞微孔培養(yǎng)板及探針板購自美國Agilent公 司；FITC偶 聯(lián)Annexin‐V凋 亡 試 劑 盒、PI/RNase染色溶液購自美國BD公司；抗caspase‐3抗體、抗caspase‐9抗體和抗cytochromec抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK‐8法檢測THP對SMMC‐7721細(xì)胞增殖的影響將處于對數(shù)生長期的人HCC細(xì)胞SMMC‐7721以5×103個/孔培養(yǎng)于96孔板（100μl/孔），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，然后分別以0、50、100、150、200、250、300μg/ml THP作用SMMC‐7721細(xì)胞，每組設(shè)置3個復(fù)孔，對照組采用DMSO處理（終濃度0.1%），同法處理以下對照組細(xì)胞。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h，作用時間到達(dá)后，每孔加入10μl CCK‐8溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱避光孵育30 min。酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下吸光度（OD），按照公式計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（OD對照孔-OD藥物孔）/OD對照孔×100%。

1.2.2 Seahorse法檢測THP對SMMC‐7721細(xì)胞能量代謝的影響選擇處于對數(shù)生長期的SMMC‐7721細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，10% RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至5×103個/孔，以5×103個/孔向細(xì)胞微孔培養(yǎng)板中加入細(xì)胞稀釋液50 μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h；THP作用SMMC‐7721細(xì)胞24 h，進(jìn)行線粒體有氧呼吸壓力測試實驗：將2.5 mol/L葡糖糖、0.2 mol/L谷氨酰胺、0.1 mol/L丙酮酸鈉加入不含血清和碳酸氫鹽的細(xì)胞培養(yǎng)基，調(diào)整pH，代謝調(diào)節(jié)藥物配置為1 μmol/L寡霉素、1 μmol/L FCCP和0.5 μmol/L魚藤酮，寡霉素添加至第1個藥物注射槽，F(xiàn)CCP加入第2個藥物注射槽，魚藤酮加入第3個藥物注射槽，選擇線粒體呼吸程序分析；糖酵解壓力測試實驗：將10 mmol/L葡糖糖加入至不含血清和碳酸氫鹽的細(xì)胞培養(yǎng)基，調(diào)整pH，代謝調(diào)節(jié)藥物配置為寡霉素10 μmol/L、2‐DG 50 mmol/L，寡霉素添加至第1個藥物注射槽，2‐DG加入第2個藥物注射槽，選擇糖酵解程序分析。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測THP對人HCC SMMC‐7721細(xì)胞凋亡的影響制備SMMC‐7721單層細(xì)胞懸液，培養(yǎng)于6孔板，細(xì)胞密度為2×105個/孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，以THP（150 μg/ml）作用SMMC‐7721細(xì)胞24 h。FITC偶聯(lián)Annexin‐V凋亡試劑盒染色SMMC‐7721細(xì)胞，細(xì)胞通過C6流式細(xì)胞儀上樣檢測，分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測THP對人HCC SMMC‐7721細(xì)胞周期的影響于6孔板制備單層SMMC‐7721細(xì)胞（2×105個/孔），37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，THP（150 μg/ml）作 用SMMC‐7721細(xì) 胞24 h。到達(dá)作用時間后，將細(xì)胞懸液收集至15 ml離心管，PBS清洗細(xì)胞、離心、棄上清；逐滴加入預(yù)冷的乙醇，旋渦振蕩細(xì)胞，4℃避光過夜；取出后離心、棄上清，PBS清洗后，PI/RNase染色液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管，上機檢測細(xì)胞周期情況。

1.2.5 Western blot檢 測THP作用SMMC‐7721細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平制備SMMC‐7721單層細(xì)胞培養(yǎng)至6孔板，細(xì)胞密度為2×105個/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，THP（150μg/ml）作用SMMC‐7721細(xì)胞24 h。到達(dá)作用時間后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度并定量。每孔加20～30 μg蛋白樣品，行SDS‐PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂乳室溫封閉，一抗孵育過夜。TBST充分洗膜后，室溫下結(jié)合山羊抗鼠IgG，TBST充分洗膜、曝光、顯影。ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism 7.04統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THP抑制SMMC‐7721細(xì)胞增殖CCK‐8檢測結(jié)果表明，THP呈劑量依賴性抑制SMMC‐7721細(xì)胞增殖（圖1）；隨著作用時間延長，THP（150μg/ml）對SMMC‐7721細(xì)胞的抑制率明顯增加，且具有時間效應(yīng)關(guān)系（圖2）。THP（150 μg/ml）對SMMC‐7721細(xì)胞的抑制率在72 h達(dá)到（43.30±3.96）%。提示THP可抑制SMMC‐7721細(xì)胞增殖。

圖1 THP對人HCC細(xì)胞SMMC‐7721活性的影響Fig.1 Effect of activity of human HCC SMMC‐7721 cells treatment with THP

圖2 THP對SMMC‐7721細(xì)胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of THP on SMMC‐7721 cells

2.2 THP抑制SMMC‐7721細(xì)胞的線粒體呼吸和糖酵解在SMMC‐7721細(xì)胞中，與對照組相比，THP（150 μg/ml）作用24 h后線粒體基礎(chǔ)呼吸［（54.62±5.03）vs（77.47±6.18）pmoles/min，P＜0.05］、ATP產(chǎn)量［（41.82±2.04）vs（61.16±3.74）pmoles/min，P＜0.05］和 最 大 呼 吸［（100.07±8.47）vs（132.00±16.77）pmoles/min，P＜0.01］顯著均降低（圖3、4），表明THP參與調(diào)控線粒體能量代謝，并降低細(xì)胞OX-PHOS水平。Seahorse XFp檢測結(jié)果表明，與對照組相 比，THP抑 制SMMC‐7721細(xì) 胞 的 糖 酵 解 水 平［（26.90±4.98）vs（37.13±2.14）pmoles/min，P＜0.05］、糖酵解能力［（75.93±1.34）vs（85.94±5.45）pmoles/min，P＜0.05］和糖酵解潛能［（43.30±4.46）vs（54.85±1.21）pmoles/min，P＜0.05］，損害SMMC‐7721細(xì)胞的有氧糖酵解途徑（圖5、6）。

圖3 THP對SMMC‐7721細(xì)胞線粒體呼吸的影響Fig.3 Effects of THP on mitochondrial respiration in SMMC‐7721 cells

圖4 THP對SMMC‐7721細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸、ATP產(chǎn)量和最大呼吸的影響Fig.4 Effects of THP on basal respiration，ATP produc-tion and maximal respiration in SMMC‐7721 cells

圖5 THP對SMMC‐7721細(xì)胞糖酵解的影響Fig.5 Effects of THP on glycolysis in SMMC‐7721 cells

圖6 THP對SMMC‐7721細(xì)胞糖酵解水平、糖酵解能力和糖酵解潛能的影響Fig.6 Effects of THP on glycolysis，glycolysis capacity and glycolysis reserve in SMMC‐7721 cells

圖7 THP對SMMC‐7721細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effects of THP on apoptosis of SMMC‐7721 cells

圖8 THP對SMMC‐7721細(xì)胞周期G1期的影響Fig.8 Effect of ATV on G1 phase of SMMC‐7721 cells

圖9 THP對SMMC‐7721細(xì)胞caspase‐3、caspase‐9和cy-tochrome c蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of THP on expressions of caspase‐3，cas-pase‐9 and cytochrome c protein in SMMC‐7721 cells

2.3 THP誘導(dǎo)SMMC‐7721細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期Annexin V‐FITC染色FCM檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，THP（150 μg/ml）作用SMMC‐7721細(xì)胞24 h后可夠誘導(dǎo)HCC細(xì)胞SMMC‐7721凋亡，凋亡率為（25.8±2.8）%（圖7）；PI/RNase流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，G1期細(xì)胞逐漸增多，G1期延長（59.02±2.5）%，顯著高于對照組，提示THP可阻滯SMMC‐7721細(xì)胞G1期，延緩?fù)暾募?xì)胞周期，THP引發(fā)的凋亡參與細(xì)胞周期阻滯反應(yīng)，進(jìn)而影響SMMC‐7721細(xì)胞增殖（圖8）。

2.4 THP介導(dǎo)SMMC‐7721細(xì)胞線粒體途徑凋亡Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，THP（150 μg/ml）作用SMMC‐7721細(xì)胞24 h后caspase‐3、caspase‐9和cytochromec表達(dá)量均增加。提示THP可誘導(dǎo)SMMC‐7721細(xì)胞凋亡，并介導(dǎo)線粒體途徑相關(guān)的細(xì)胞凋亡（圖9）。

3 討論

在我國癌譜構(gòu)成中，HCC是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居第4，死亡率位居2，且呈上升趨勢。國際癌癥研究最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，中國HCC的發(fā)病及死亡數(shù)約占全球HCC總數(shù)的50%［7‐8］。盡管目前治療取得了進(jìn)展，但HCC仍然是最惡性的疾病之一。THP是中藥延胡索的主要有效成分之一，屬于異喹啉類化合物，具有多種生物學(xué)活性，如鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮、鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗?jié)儭⒖剐募∪毖翱鼓[瘤等功效［9］。目前，THP對人HCC細(xì)胞SMMC‐7721抑制增殖作用的研究鮮有報道。因此，本研究以THP作用人肝癌細(xì)胞SMMC‐7721，探討其對SMMC‐7721細(xì)胞抗增殖左右的影響及機制。結(jié)果表明，在細(xì)胞生物活性方面，藥物作用時間一定條件下，隨著藥物劑量增加，THP對SMMC‐7721細(xì)胞抑制率有不同程度地提高，具有劑量效應(yīng)關(guān)系（P＜0.01）；在藥物劑量一定條件下，隨著作用時間延長，THP對SMMC‐7721細(xì)胞抑制率顯著升高，具有時間效應(yīng)關(guān)系（P＜0.01）。

癌癥通過改變新陳代謝、腫瘤細(xì)胞重編程營養(yǎng)物質(zhì)獲取和代謝途徑滿足腫瘤細(xì)胞的生物合成和氧化還原需求，使腫瘤細(xì)胞無限制地增殖成為可能。干預(yù)及紊亂腫瘤細(xì)胞代謝途徑成為目前抑制腫瘤細(xì)胞增殖的新思路。線粒體在細(xì)胞中的主要功能是通過產(chǎn)生ATP為細(xì)胞代謝和生物合成提供能量，對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的存活至關(guān)重要［10‐11］。科研組采用目前較先進(jìn)的細(xì)胞能量代謝測定手段Seahorse XFp體外能量分析儀，通過免標(biāo)記固態(tài)傳感器同時測量細(xì)胞兩條主要的能量代謝通路，即線粒體呼吸和糖酵解。線粒體依賴有氧進(jìn)行OXPHOS產(chǎn)生ATP，OCR代表線粒體呼吸作用，因此通過檢測細(xì)胞的OCR來評估細(xì)胞線粒體呼吸；腫瘤細(xì)胞在不依賴于氧氣通過糖酵解產(chǎn)生ATP，并同時產(chǎn)生乳酸和質(zhì)子，通過檢測（extracellular acidification rate，ECAR）觀察糖酵解水平［12］。本研究采用細(xì)胞外能量分析系統(tǒng)測量細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸活性，通過氧氣消耗率可展現(xiàn)基礎(chǔ)呼吸、ATP產(chǎn)量及最大呼吸量，最終反映OXPHOS水平。研究表明，THP導(dǎo)致線粒體功能破壞，減少OXPHOS水平，進(jìn)而阻斷腫瘤細(xì)胞增殖所需能量；Seahorse測定了SMMC‐7721細(xì)胞的ECAR，表明THP可誘導(dǎo)SMMC‐7721細(xì)胞抗有氧糖酵解效應(yīng)，THP通過降低SMMC‐7721細(xì)胞糖酵解功能阻斷腫瘤細(xì)胞第二種供能方式——有氧糖酵解。

多數(shù)抗腫瘤化合物可能具有復(fù)雜的機制，但誘導(dǎo)及調(diào)控凋亡的信號通路是最關(guān)鍵的。近年報道指出THP可誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞、人鼻咽癌細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期［13‐15］。本研究流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，THP不僅可以誘導(dǎo)SMMC‐7721細(xì)胞凋亡，同時還阻滯SMMC‐7721細(xì)胞周期，延長G1期，延緩?fù)暾募?xì)胞周期進(jìn)程，印證并完善了THP在抗腫瘤方面的作用。線粒體膜受損可改變線粒體通透性，使△Ψm下降，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹，釋放促凋亡因子cyto-chromec。cytochromec與caspase‐9結(jié)合形成凋亡小體，進(jìn)而激活凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者caspase‐3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16‐17］。研究發(fā)現(xiàn)，caspase作為機體內(nèi)不活躍的形式酶，在腫瘤細(xì)胞面臨氧化應(yīng)激時，觸發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，將cytochromec從線粒體釋放到胞質(zhì)，介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。

綜上，本研究首次證明THP可抑制線粒體OX-PHOS和糖酵解產(chǎn)生，誘導(dǎo)過度氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，這是介導(dǎo)SMMC‐7721細(xì)胞線粒體凋亡途徑的潛在機制。以上特點可為腫瘤治療提供新思路和新方式，同時也表明THP具有開發(fā)為臨床治療肝癌藥物的潛力。