茯苓多糖改善HDL功能并通過PPARγ/LXRα/ABCA1抗AS機制研究①

于寧 宋囡 王瑩 楊關林 賈連群（遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847）

近年來，心血管疾病患病率與死亡率仍處于逐年上升階段，死亡率居首位，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，已成為重大的公共衛(wèi)生問題，防治心血管疾病刻不容緩［1］。動脈粥樣硬化（atherosclero-sis，AS）為心血管疾病的主要病理學基礎，主要表現(xiàn)為大、中動脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，內(nèi)膜增厚隆起，中膜平滑肌細胞和基質(zhì)增生，最終導致管腔狹窄至閉塞［2］。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運（cholesterol reverse transport，RCT）為改善AS脂質(zhì)沉積的主要機制，是指作為受體的高密度脂蛋白將泡沫細胞及動脈粥樣硬化斑塊等肝外組織細胞中的膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟進行分解代謝，合成分泌膽汁，通過腸道排出體外的過程，是正常機體維持脂代謝平衡的重要機制之一［3］。PPARγ/LXRα/ABCA1信號通路是參與RCT的經(jīng)典通路之一。流行病學研究顯示，HDL‐C與心血管事件呈負相關，HDL‐C濃度每升高1 mg/dl，冠心病的風險就會降低2%～3%［4］。HDL參與RCT，發(fā)揮抗氧化、抗炎功能。但在慢性炎癥、血脂異常、糖尿病、AS等病理條件下，HDL的結(jié)構(gòu)和成分發(fā)生改變，導致功能異常，即成為dyHDL，dyHDL可阻礙RCT過程［5］。研究表明，茯苓多糖具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、防治肝損傷、心腦血管疾病的作用［6］。本研究以dyHDL與膽固醇逆轉(zhuǎn)運為切入點，探討茯苓多糖作為藥物干預是否能夠通過改善dyHDL并促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運PPARγ/LXRα/ABCA1信號通路防治AS，為AS防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物32只SPF級ApoE‐/‐小鼠，6～8周齡，體重20～22 g，同齡遺傳背景相同的C57BL/6J小鼠10只，所有動物購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2012‐0001，遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，自由攝食飲水，溫度（22±5）℃，濕度（50±2）%。

1.1.2 藥物及試劑茯苓多糖（索萊寶，批號A6520）；辛伐他汀（杭州制藥有限公司州默沙東，批號J20180007）；ABCA1抗 體（Immunoway，批 號YN2847）；PPARγ抗體、LXRα抗體（proteintech，批號分別為16643‐1‐AP、14351‐1‐AP）；β‐actin抗體（康為試劑，批號CW0096）；CYP7A1抗體、SR‐B1抗體（博奧森，批號分別為bs‐2399R、bs‐1186R）；小鼠SAA ELISA試劑盒、小鼠S1P ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號分別為ml001976、ml062988）。

1.1.3 實驗儀器7500 Real‐time PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；梯度PCR儀（美國ABI，veriti 96 well Thermal Cycler）；全自動生化分析儀（日本東芝，TBA‐120FR）；濕轉(zhuǎn)印電泳槽、垂直電泳槽（美國Bio‐Rad）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、造模與給藥全部ApoE‐/‐小鼠，給予高脂飼料喂養(yǎng)，8周后抽取2只，光學顯微鏡下觀察小鼠主動脈斑塊是否已形成作為判斷造模成功與否的標志。按隨機數(shù)字表法將小鼠分為模型組、茯苓多糖組、辛伐他汀組，每組10只。10只C57BL/6J小鼠作為正常組。正常及模型組給予生理鹽水，茯苓多糖組給予茯苓多糖，按0.2 g/（kg·d），0.5 ml/次，灌胃，給藥4周。正常組喂養(yǎng)普通飼料，模型組、茯苓多糖組、辛伐他汀組喂養(yǎng)高脂飼料。

1.2.2 血脂檢測采用10%水合氯醛麻醉小鼠，腹主動脈取血，將血液放入促凝管中放置2 h后，2 500 r/min，離心20 min，將上清吸于1.5 ml EP管中，-80℃保存。全自動生化分析儀檢測TG、TC、HDL‐C、LDL‐C含量。

1.2.3 HE、油紅O染色法檢測肝臟脂質(zhì)沉積情況HE染色：將小鼠肝臟置于4%多聚甲醛中，梯度脫水，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，用HE染色，洗滌10 min，95%乙醇脫水2次，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察肝臟病理組織學形態(tài)。

油紅O染色：將放置于4%多聚甲醛中的肝臟取出，包埋，制備厚度為8～10μm的冰凍切片，油紅O染色10 min，75%酒精分化2 s，水洗1 min，蘇木素復染2 min，自來水洗滌。1%鹽酸酒精分化并水洗，氨水藍水洗后甘油明膠封片，光學顯微鏡下觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況。

1.2.4 ELⅠSA法檢測小鼠血清SAA、S1P含量將小鼠血清吸取于1.5 ml的EP管中，設計排版，分別設置標準品孔、空白孔、樣品孔，標準品孔加入50μl的標準品，樣品孔加入樣品稀釋液40μl、樣品10μl，依次進行加酶、溫育、洗滌、顯色，最后加終止液，以空白孔調(diào)零，450 nm波長測定每孔吸光度。

1.2.5 Real time RT‐PCR法檢測小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1mRNA表達稱取小鼠肝臟100 mg，RNA提取試劑盒提取小鼠肝臟RNA，去除DNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green進行實時熒光PCR。PCR反應程序設定：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。ΔCT值為目的mRNA CT值與內(nèi)參mRNA CT值的差值，ΔΔCT為各實驗組ΔCT與空白對照組ΔCT的差值，平均相對含量=2‐ΔΔCT。實驗重復3次。引物序列見表1。

1.2.6 Western blot法檢測小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1蛋白表達稱取小鼠肝臟100 mg，加入已加入蛋白酶抑制劑的RIPA 1 ml，組織研磨，4℃12 500 r/min離心15 min，吸取上清于1.5 ml EP管中，BCA蛋白定量測定各組肝臟濃度，計算上樣量，加入2×上樣緩沖液，100℃變性5 min，每組按照60μg電泳，分離膠80 V 15 min，濃縮膠100 V 30 min，電泳完成后進行轉(zhuǎn)膜，100 V 80 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育過夜，1×TBST洗滌3次，每次15 min，二抗孵育1 h，1×TBST洗滌3次，每次15 min，制備發(fā)光液，曝光，分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血脂水平與正常組比較，模型組小鼠血清TG、TC、LDL‐C水平明顯升高（P＜0.01），HDL‐C明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，茯苓多糖、辛伐他汀組TG、TC、LDL‐C水平明顯降低（P＜0.01），HDL‐C明顯升高（P＜0.01）。見表2。

表1 Real time RT‐PCR的相關引物序列Tab.1 Related primer sequences of Real time RT‐PCR

2.2 各組小鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況HE染色：正常組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉中央可見呈發(fā)射狀排列的肝索和肝血竇。肝細胞圓形，胞質(zhì)均質(zhì)嗜酸性，細胞核較大、圓形；模型組肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝血竇受壓變窄。肝細胞體積增大，胞質(zhì)疏松，可見雙核肝細胞；茯苓多糖與辛伐他汀組肝臟結(jié)構(gòu)恢復接近正常組。肝細胞呈條索狀排列，肝細胞索間可見肝血竇，肝細胞圓形，胞質(zhì)均質(zhì)嗜酸性，細胞核較大、圓形。見圖1A。

油紅O染色：正常組肝細胞內(nèi)未見細胞腫脹和脂肪變性；模型組肝細胞發(fā)生明顯的脂肪變性，肝細胞內(nèi)可見大小不等的脂肪滴；茯苓多糖與辛伐他汀組肝組織中脂滴含量較模型組明顯減少，接近正常組。見圖1B。

2.3 各組小鼠血清SAA、S1P含量與正常組比較，模型組小鼠血清SAA含量明顯升高，S1P明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，茯苓多糖組、辛伐他汀組SAA含量明顯降低，S1P含量明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

2.4 各 組 小 鼠 肝 臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1 mRNA表達與正常組比較，模型組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，茯苓多糖組、辛伐他汀組PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1 mRNA表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

表2 各組小鼠血清TG、TC、HDL‐C、LDL‐C水平（±s）Tab.2 Levels of TG，TC，HDL‐C and LDL‐C in serum of mice in each group（±s）

表2 各組小鼠血清TG、TC、HDL‐C、LDL‐C水平（±s）Tab.2 Levels of TG，TC，HDL‐C and LDL‐C in serum of mice in each group（±s）

Note：Compared with the control group，1）P＜0.01；compared with the model group，2）P＜0.01.

圖1 各組小鼠肝臟HE、油紅O染色情況Fig.1 Staining of HE and Oil Red O in liver of mice in each group

圖2 各組小鼠血清SAA、S1P含量Fig.2 Contents of SAA and S1P in serum of mice in each group

圖3 各組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1mRNA表達情況Fig.3 Expression of PPARγ，LXRα，ABCA1，CYP7A1 and SR‐B1 mRNA in liver of mice in each group

圖4 各組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1蛋白表達情況Fig.4 Protein expression of PPARγ，LXRα，ABCA1，CYP7A1 and SR‐B1 in liver of mice in each group

2.5 各組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1蛋白表達與正常組比較，模型組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，茯苓多糖組、辛伐他汀組PPARγ、LXRα、ABCA1、CYP7A1、SR‐B1蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

AS以動脈壁脂質(zhì)沉積、細胞死亡和斑塊纖維化為特征，是冠心病、腦梗死、外周血管狹窄等多種缺血性心腦血管疾病的共同病理基礎，目前認為是一種特殊形式的慢性炎癥，嚴重威脅人類健康。因此，防治AS具有重要意義［7‐8］。中醫(yī)將其歸為“心悸”“胸痹”“中風”“脈痹”“脫疽”的范疇，認為多由本虛標實所致。脾氣虛弱無力，水谷精微失于運化，水濕內(nèi)生，聚而為痰，瘀阻脈絡，成痰瘀阻絡之勢，日久形成AS等心腦血管疾病。《諸病源候論·諸痰論》曰：“諸痰者，此由血脈壅塞，飲水積聚而不消散，故成痰也”，說明“血中之痰濁”是血脂異常、AS的致病因素［9］。茯苓多糖是茯苓的主要單體成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗遺傳損傷、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗病毒、抗氧化、護肝催眠等藥理作用［10‐11］。研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖能夠增強細胞免疫，特別是巨噬細胞的吞噬活性，能通過活化肝臟細胞的AKT信號通路，抑制NF‐κB信號通路改善肝損傷［12］。臨床在心血管疾病治療上常采用桂枝與茯苓協(xié)同防治心血管疾病。有文獻報道，二者協(xié)同具有抑制NF‐κB及MMP‐2的表達作用，從而重塑進程動脈粥樣硬化大鼠模型心臟微小血管，顯著降低血清和腦組織中TNF‐α、ET‐1水平，提高缺血腦組織的供血速度，對缺血腦組織啟動保護機制［13］。茯苓多糖可通過抑制IL‐33/ST2信號通路的激活，減少肥大細胞活化，抑制炎癥因子的表達，降低結(jié)腸炎癥浸潤程度［14］。關于茯苓多糖對肝臟脂質(zhì)代謝方面的研究尚不多見［15‐16］。因此，針對脾虛痰濁內(nèi)生的中醫(yī)病機，課題組采用具有健脾化痰功效的茯苓的主要成分茯苓多糖作為藥物干預，探討其是否通過調(diào)節(jié)肝臟膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程進而改善AS。實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，茯苓多糖能夠顯著降低血清TG、TC、LDL‐C水平，升高HDL‐C水平，肝臟組織結(jié)構(gòu)接近于正常，肝細胞呈條索狀排列，肝細胞索間可見肝血竇，脂肪空泡明顯減輕，表明茯苓多糖可在一定程度上改善血脂水平，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，進而改善AS。

眾所周知，HDL‐C是AS的保護因素，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)單純增加HDL‐C的數(shù)量并不能有效降低AS的風險，人們逐漸意識到HDL不單純是量的改變，更應該關注質(zhì)的變化［17］。國際上，將正常的HDL稱為功能性HDL，其具有抗氧化、抗炎、抗血栓、促纖溶以及改善內(nèi)皮細胞功能等生物學活性。在急性期、慢性炎癥及一些代謝性疾病中，HDL會發(fā)生一系列的病理性修飾，導致其組成成分以及功能基團發(fā)生改變，將此類HDL稱為“失功能HDL”（dyHDL）［18］。S1P具有抗AS的作用，存在于HDL外層，是鞘磷脂代謝的中間產(chǎn)物之一，既可作為細胞內(nèi)第二信使發(fā)揮作用，又可與HDL表面上的特定細胞受體（S1PR）結(jié)合而發(fā)揮其生物學效應［19‐21］。血漿中60%～80%的S1P通過ApoM與HDL結(jié)合，參與調(diào)節(jié)HDL的抗氧化、抗炎等效應［22］。臨床研究證明HDL‐S1P含量與冠心病程度呈負相關，我國學者研究發(fā)現(xiàn)，冠心病PCI術(shù)后HDL‐S1P含量高的患者，再狹窄率顯著降低［23］。SAA是一種急性相反應蛋白，與脂蛋白相聯(lián)系，在炎癥發(fā)生時，SAA的表達會升高1 000倍，取 代HDL的 主 要 載 脂 蛋 白ApoAI［24］。SAA會牢牢吸住位于動脈壁上的HDL，抑制HDL與周圍細胞膽固醇結(jié)合，抑制LCAT活性，從而降低了ApoAI介導的RCT，且加速血液循環(huán)中HDL的清除。有研究表示HDL組分SAA/ApoAI比值具有評估dyHDL含量的價值［25］。因此，通過檢測血清S1P、SAA含量可側(cè)面反映dyHDL含量。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠血清S1P明顯降低，SAA明顯升高，說明ApoE‐/‐小鼠HDL功能明顯降低。與模型組比較，茯苓多糖及辛伐他汀組小鼠血清S1P明顯升高，SAA明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義，說明茯苓多糖能夠糾正HDL失功能狀態(tài)改善AS。

PPARγ為過氧化物酶體增殖物激活受體家族一員，主要分布于肝臟和脂肪組織中，在調(diào)控糖脂代謝、抗炎、抗AS的發(fā)展中具有重要作用。PPARγ通過激活下游效應分子上調(diào)ABCA1和SR‐B1的表達，促進巨噬細胞膽固醇的流出，抑制巨噬細胞的泡沫化，抑制AS的形成［26‐27］。LXRα是核受體超家族成員，在肝臟、腎臟、巨噬細胞中大量分布，具有調(diào)節(jié)膽固醇代謝的作用，通過調(diào)控下游基因AB-CA1，促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運［28‐29］。機體內(nèi)膽固醇清除的經(jīng)典有效途徑是在膽固醇7α‐羥化酶（CYP7A1）的作用下生成膽汁酸，而CYP7A1基因是LXRα的下游基因，故LXR‐α也有調(diào)控膽汁酸的作用［30］。SR‐B1能夠介導肝臟攝取膽固醇并促進膽汁分泌，從而促進RCT，抑制AS的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)dyHDL可阻礙RCT過程，存在于HDL外膜的SAA、S1P等因子導致HDL失功能，抗氧化、抗炎、保護內(nèi)皮細胞等功能失調(diào)，阻礙RCT的發(fā)生，肝臟脂質(zhì)代謝失調(diào)，進而導致AS的發(fā)生［31］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、SR‐B1、CYP7A1 mRNA、蛋白表達顯著降低；與模型組比較，茯苓多糖與辛伐他汀組小鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1、SR‐B1、CYP7A1 mRNA、蛋白表達顯著升高，綜合ELISA結(jié)果中茯苓多糖組SAA表達下調(diào)、S1P表達上調(diào)，說明茯苓多糖能夠通過恢復HDL功能并促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運通路PPARγ‐LXRα‐AB-CA1改善ApoE‐/‐小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，防治AS。

基于以上研究，本課題組認為茯苓多糖可能通過抑制dyHDL，即恢復HDL功能并通過膽固醇逆轉(zhuǎn)運通路PPARγ‐LXRα‐ABCA1改善ApoE‐/‐小鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況，有望為茯苓多糖防治心腦血管疾病提供新的思路和方法。有關茯苓多糖的含量，給藥時 間 與改善HDL功能并通過PPARγ/LXRα/AB-CA1抗AS有否依賴關系，本課題組還會進一步研究，并在體外實驗中進行驗證。