1株人感染柯薩奇病毒A組16型B1b亞型的分離和鑒定*

杜加亮，劉 艷，于晴川，張 永，趙榮榮，趙 巖，韓 菲，劉悅越

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

柯薩奇病毒A16(CV-A16)是小RNA病毒科腸道病毒屬的成員，是引起嬰幼兒手足口病(HFMD)的常見病原體之一[1]。CV-A16是含有約7.4 kb基因組的正義單鏈RNA病毒，其基因組包含5′端非翻譯區(5′UTR)、結構蛋白編碼區P1、非結構蛋白編碼區P2/P3及3′非翻譯區(3′UTR)。P1編碼4種結構蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)，P2和P3分別編碼7種非結構蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[2]。隨著研究的不斷深入，在分子流行病學方面，基于VP1基因的完整序列，CV-A16可以在系統發育上分為A、B、C和D 4個基因組[3-6]。基因組B可以進一步分為B1～B4這4個基因亞型，其中B1基因亞型還可以細分為B1a～B1d[3,7]。在基礎研究方面，利用反向遺傳學技術構建感染性克隆[8]，能夠在體外對病毒基因組進行突變、缺失、嵌合等操作后，獲得表型、性狀發生變化的拯救病毒，為研究其基因的結構與功能、病毒復制機制、致病機制及篩選候選疫苗提供了嶄新的途徑。在疾病預防控制方面，單價腸道病毒71 型(EV-A71)疫苗無法預防其他病原體引起的HFMD及其他相關疾病，應研發多價HFMD 疫苗[9]，而EV-A71和CV-A16交替或共同流行可引發世界多個國家或地區HFMD暴發。本研究從CV-A16的分離、鑒定、系統進化分析、檢測方法建立和全基因組克隆構建等方面進行了一系列研究，以期為CV-A16 病毒的分子流行病學和基礎研究提供有利的工具。

1 材料與方法

1.1細胞 RD細胞為人惡性胚胎橫紋肌瘤細胞，為本實驗室保存。細胞培養液為含有1%(v/v)L-谷氨酰胺(200 mmol/L)、2.5%(v/v)NaHCO3溶液(7.5%)、10%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)雙抗的Gibco D-MEM培養液。

1.2材料 一步法熒光定量PCR試劑盒(RR064)和一步法反轉錄PCR(RT-PCR)試劑(RR057)購自TaKaRa公司，QIAamp Viral RNA Mini 試劑盒購自QIAGEN公司。糞便處理液為含有終濃度為500 U/mL青霉素和500 μg/mL鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3病毒分離 糞便標本來源于臨床診斷為HFMD和實驗室診斷為CV-A16感染的患者。取糞便標本1 g加入10 mL糞便處理液中，渦旋混勻30 s，4 000 r/min離心30 min，取上清，除菌過濾后接種于RD細胞。在倒置顯微鏡下每日觀察細胞病變情況，7 d后觀察若未出現細胞病變，盲傳兩代，直至出現超過75%的細胞病變后，將其在—70 ℃以下凍存。

1.4分離毒株的分子生物學鑒定 步驟1.3中的凍存液反復凍融3次后，吸取200 μL，按照QIAamp Viral RNA Mini 試劑盒說明書的步驟提取病毒RNA。按照一步法反轉錄PCR試劑(RR057)說明書，利用CV-A16特異性引物CA-VP1-F和CA-VP1-R(終濃度均為10 μmol/L)，進行一步法反轉錄PCR擴增VP1基因(反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、35個循環；72 ℃充分延伸7 min)，探針引物信息見表1。目的條帶經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后測序驗證，并參照文獻與GenBank中的已知基因型和亞型的毒株序列進行比對，利用Mega軟件構建Neighbour-joining系統進化樹。

1.5病毒滴度檢測 將長成致密單層的Vero細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成濃度為2×105/mL的細胞懸液備用；同時將待測病毒進行10倍系列稀釋，取稀釋度為10-10～10-3的病毒液按每孔50 μL接種細胞，每個稀釋度設置8個復孔；然后立即將細胞懸液按每孔50 μL加入96孔板；同時設置細胞對照(100 μL細胞懸液+100 μL病毒稀釋液)，36 ℃培養7 d后觀察細胞病變。以能使細胞發生病變的病毒最高稀釋度作為終點。在顯微鏡下觀察到細胞病變記為“+”，否則記為“-”。按Behrens-Krber公式計算出分離病毒株的病毒滴度(log CCID50)=L—d (S —0.5)，其中：L=實驗中使用的最低稀釋度的log值；d=稀釋梯度的log值；S=終判時陽性部分的總和(即出現CPE的細胞孔所占的比例之和)。

1.6分離毒株對乳鼠的致病性 將增殖后的病毒懸液反復凍融3次，然后在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液。實驗用7 d齡Balb/c乳鼠由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供，同時設實驗組和對照組，5只/組，實驗組注射病毒液20 μL(100 CCID50)，對照組注射等量培養液，顱內注射，逐日觀察并記錄乳鼠發病情況。

1.7全基因組克隆構建 參照步驟1.4中的方法提取病毒RNA，利用分片段引物(見表1)，擴增全長基因。目的條帶經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收后，與pEASY-T3載體連接。轉化DH5α大腸埃希菌感受態后，經過藍白斑篩選、酶切鑒定和測序驗證，提交GenBank。根據全長序列酶切位點分析，選擇合適的酶切位點將全長序列分兩段擴增克隆至pVAX載體，構建全基因組克隆，酶切鑒定和測序驗證。

1.8檢測方法建立

1.8.1RT-PCR方法建立 針對VP1設計引物探針，見表1，設計一步法RT-PCR。1×Taqman universal master mix Ⅱ 25 μL；CA-F(20 μmol/L)、CA-R(20 μmol/L)和CA-P(20 μmol/L)各5 μL，RNA 5 μL；反應條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min；40個循環。

1.8.2質粒參考品制備 將VP1編碼基因克隆入pEASY-T3載體作為質粒參考品。質粒純度符合要求吸光度(A)260/280為1.8～2.0)后作為備用參考品原液。質粒拷貝數(copy/μL)按照以下公式計算：(6.02×1023)×(質粒濃度ng/μL×10-9)/(質粒長度bp×660)。本研究中使用稀釋至106、105、104、103、102copy/μL的質粒作為參考品。

表1 探針引物信息

2 結 果

2.1人感染CV-A16分離株的生物學特征 成功地從HFMD患者的糞便標本中分離到1株CV-A16(BJ1208)。該病毒在RD細胞中培養時可以觀察到明顯的致細胞病變現象，見圖1；在RD細胞增殖后的病毒滴度為6.8 log CCID 50/mL；以100 CCID50(20 μL)的病毒量在Balb/c乳鼠顱內注射后可以觀察到典型的后肢癱瘓癥狀，見圖2。

注：A為人感染CV-A16接種RD細胞；B為細胞對照。

上的細胞病變現象(×10)

注：A為人感染CV-A16感染小鼠；B為正常小鼠對照。

肢癱瘓癥狀

2.2人感染CV-A16分離株的分子生物學特征 分段擴增(圖3)測序后拼接獲得該病毒的完整基因組序列(GenBank Accession No.:JX507808)，全長7 406 bp，包括745 bp的5′UTR、6 579 bp的蛋白編碼區(編碼2 193個氨基酸)及82 bp的3′UTR。根據CV-A16 VP1序列構建的系統進化樹顯示，該病毒分離株為B1b亞型，且與俄羅斯2007年分離株(KC879501)具有最近的親緣關系，見圖4。但是與其他病毒相比，明顯不同的是該分離株在VP1編碼蛋白中(688～690 bp處)缺少一個蛋氨酸，見圖5。但從其生物學特征來看，該缺失并不影響病毒復制和感染能力。

注：M1為DL2000 DNA 標記物；M2為1 kb ladder；泳道1-2、3-6、7-8、9-13、14-18分別是CV-A16 F1～F5 5個PCR擴增片段TA克隆的酶切鑒定結果。

克隆的酶切鑒定結果

2.3全基因組克隆構建 對全基因組進行酶切位點分析，利用一個單酶切位點(EcoR V)及基因組中未含有的兩個酶切位點(Pme I 和Not I)，將基因組分成兩個片段依次擴增克隆和連接至載體pVAX1中，構建全基因組克隆pVAX1-CA16。經酶切(Pme I+ EcoR V)(約3.6和6.9 kb兩個片段，見圖6)和測序驗證了基因組克隆后未發生基因突變。

注：▲表示本研究中的病毒分離株BJ1208。

圖5 CV-A16 BJ1208 VP1編碼區核苷酸比較(部分)

2.4檢測方法 由4次重復檢測結果可見，質粒標準品的濃度對數與循環閾值(Ct值)在102～106copy/μL呈現明顯的線性相關(Y=-1.602 ln(X)+36.873,R2=0.999 9)，可用作該毒株的定性檢測和病毒增殖滴度定量檢測。

注：1為未酶切質粒對照；2為質粒經Pme I+EcoR V雙酶切；M為DNA標記物。

3 討 論

本研究成功從HFMD患者的糞便標本中分離到1株在體內(Balb/c乳鼠)和體外(RD細胞)均具有典型生物學特征的B1b亞型CV-A16(BJ1208)病毒。建立了一套從病毒分離、鑒定、系統進化分析、全基因組擴增和克隆到熒光定量檢測方法建立的技術平臺，為該類病毒的后續研究提供了參考。

雖然CV-A6、CV-A10等病原體在亞洲、美洲和歐洲逐漸取代EV-A71和CV-A16成為引起HFMD暴發或流行的主要病原體，但是傳統的病原體仍然不能被忽視[10]。CV-A16感染可導致多種疾病，從輕度HFMD、皰疹性咽峽炎、上下呼吸道疾病到嚴重并發癥，如腦炎、癱瘓、脊髓炎、腦膜炎，甚至死亡。CV-A16的基因型和基因亞型眾多，但是型別與疾病嚴重程度之間的關系尚不十分明確。CV-A16病毒B1b亞型在我國多個省份均有報道[11]，并且田曉靈等[12]發現內蒙古自治區不同臨床癥狀患者中分離出的CV-A16代表株在分子基因型/基因亞型及親緣進化關系樹分布上雖無明顯差異，但大部分的重癥病例和死亡病例感染病毒都分布在B1b分支中。本研究中分離到的B1b亞型CV-A16(BJ1208)病毒來源于重癥患者的糞便標本，這提示在疾病監測過程中應重視收集基因型/亞型與疾病嚴重程度的關系數據，為疾病的治療及疫苗毒株的選擇提供依據。

通常認為，CV-A16 的VP1編碼區氨基酸序列相對于其他腸道病毒較為保守，且與其抗原性密切相關[13]。因此，這一區域發生的氨基酸特性改變可能對蛋白質空間結構有一定的影響，從而導致毒力的改變[14-17]。本研究中的分離株BJ1208雖然在VP1編碼蛋白中(688～690 bp處)缺少一個蛋氨酸。但從其生物學特征和臨床來看，該缺失并不影響病毒復制和感染能力。得益于反向遺傳操作技術的成功應用，可以從基因型的改變來研究表型的變化。以往研究多是利用T7聚合酶系統以線性化的重組質粒為模板進行體外轉錄反應得到CA16病毒基因組RNA，并將CAl6基因組RNA轉染至適宜細胞獲得拯救病毒。而以CMV為啟動子實現病毒拯救的策略可以利用哺乳動物細胞內天然的Ⅱ類RNA聚合酶來實現轉錄，在操作上更為簡捷[18]，可以用于研究基因突變、缺失或插入等改變對病毒性狀的影響。

pVAXl是在載體pcDNA3.1的基礎上改建而成的一種新型真核表達載體，是美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的唯一一個可以用于DNA疫苗的載體。該質粒含有的強啟動子pCMV和BGH poly A信號可以在哺乳動物細胞中高水平表達重組蛋白[19]。與經典的T7啟動子相比，少了體外轉錄的步驟。本研究利用pVAXl作為載體構建了全基因組克隆，下一步工作是在此基礎上對全基因組克隆進行改造，如在5′和3′端增加核酶來提高剪切精確度等[20]，實現病毒拯救，以期為病毒基因型和表型關系的研究提供更便捷的工具。

本研究建立了一個基于CV-A16病毒的分離鑒定體系，以期為復雜多樣的HFMD病原體的相關研究提供更多的參考。