血小板參數和血小板聚集功能檢測對2型糖尿病治療后監測的臨床價值探討*

趙 玲，楊伏猛，婁煥堃，劉婷婷，馬 芳，梁 偉△

1.蚌埠醫學院,安徽蚌埠 233000；2.蚌埠醫學院附屬連云港市第二人民醫院檢驗科,江蘇連云港 222000；3.江蘇省連云港市東海縣人民醫院口腔科，江蘇連云港 222300

隨著人們生活水平的提高和人口老齡化的到來，糖尿病已經成為繼腫瘤、心血管疾病之后發病率居世界第3位的慢性病，嚴重威脅著人類的健康和生命。研究表明，90%以上的糖尿病患者主要死于心腦血管疾病并發癥，而心腦血管疾病的發生、發展與血小板高活性狀態密切相關[1]。研究表明，2型糖尿病(T2DM)患者的血小板處于高活性狀態，因此，早期預防和治療是阻止T2DM心腦血管疾病并發癥發生、發展的關鍵[2]。本研究旨在探討血小板參數、血小板聚集功能及血小板P-選擇素和磷脂酰絲氨酸(PS)外翻檢測對T2DM患者治療后監測中的臨床價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年4—9月于蚌埠醫學院附屬連云港市第二人民醫院內分泌科進行住院治療的非初診T2DM患者60例納入治療組。選取同期蚌埠醫學院附屬連云港市第二人民醫院內分泌科門診確診、初發、未經治療的T2DM患者60例納入初發組。選取同期排除T2DM的健康體檢者60例納入對照組。所有確診患者均符合2016年美國糖尿病協會(ADA)制定的糖尿病診斷標準及分型標準。3組研究對象的年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。排除標準：(1)急性創傷或急慢性感染患者；(2)原發或其他繼發性腎臟疾病患者；(3)急慢性心、肝、肺、腎、心腦血管、消化道疾病患者；(4)惡性腫瘤、自身免疫性疾病患者；(5)采集血液標本前2周未使用過抗血小板藥物或抗凝藥物。本研究經蚌埠醫學院附屬連云港市第二人民醫院醫學倫理委員會審批通過，符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求，研究對象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 血小板計數(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板分布寬度(PDW)、血小板平均體積(MPV)的檢測采用Sysmex XN-1000全自動血細胞分析儀及其配套試劑(日本希森美康公司生產)；分別應用二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)和膠原(COL)作為血小板誘導劑，使用LBY-NJ4A血小板聚集儀(北京泰利康信公司生產)檢測各組研究對象的血小板最大聚集率(PAgTm)，AA、ADP及COL所對應的試劑批號分別為20200427A、20200425B、20200424C，嚴格按照儀器標準化操作規程進行操作。流式細胞儀(美國BD公司)檢測血小板P-選擇素表達和PS外翻，試劑分別采用FITC標記的抗P-選擇素單克隆抗體和APC標記的Annexin V。

表1 3組研究對象一般資料比較

1.3標本采集 (1)采集空腹靜脈血2 mL，采用15%乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，進行血小板參數檢測；(2)采集空腹靜脈血3 mL，采用109mmol/L的枸櫞酸鈉以1∶9比例進行抗凝，采血完畢后及時混勻，避免使用溶血、脂血和乳糜血的標本，將采血管在160×g的離心力下離心10 min，分離富血小板血漿(PRP)；然后繼續在2 000×g的離心力下離心10 min，分離乏血小板血漿(PPP)，PRP與PPP制備完成后分別以AA、ADP及COL作為誘導劑應用LBY-NJ4A血小板聚集儀來檢測每例研究對象第300秒所對應的PAgTm。所有檢測指標均要求4 h內完成。(3)制備洗滌血小板。取健康體檢者或糖尿病患者靜脈血與ACD(2.5%枸櫞酸鈉、2.0%葡萄糖、1.5%枸櫞酸)按照1∶7比例抗凝，1 300 r/min離心20 min得到PRP，PRP經2 500 r/min離心20 min，沉淀用CGS緩沖液懸浮，經離心、洗滌，最后用MTB液重懸，得到洗滌血小板，調整血小板計數為3×108/mL，室溫靜置1～2 h使其恢復至靜息狀態以備用。

1.4檢測方法 (1)PLT、PCT、PDW、MPV采用電阻抗法在全自動血液分析儀上檢測；PAgTm采用光電比濁法檢測。所有標本檢測前，儀器均經過維護和校準，且室內質控符合要求方可實施檢測。(2)流式細胞儀檢測PS外翻：3 ×108/mL洗滌血小板50 μL加入250 μL 1 × Annexin V結合緩沖液和10 μL FITC標記的Annexin V，在避光、震蕩條件下室溫孵育20 min后，采用流式細胞儀進行檢測，并記錄Annexin V陽性細胞百分比。(3)流式細胞儀檢測血小板P-選擇素表達：3× 108/mL洗滌血小板50 μL加0.25 μL FITC標記的抗P-選擇素單克隆抗體，室溫孵育30 min，采用流式細胞儀檢測。

2 結 果

2.13組間血小板參數及PAgTm比較 治療組MPV明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.001)，而PCT、PDW、PLT、AA-PAgTm、ADP-PAgTm、COL-PAgTm在兩組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；初發組MPV、AA-PAgTm、ADP-PAgTm、COL-PAgTm明顯高于對照組和治療組，差異有統計學意義(P<0.001)；而PCT、PDW、PLT在3組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.23組間血小板P-選擇素表達和PS外翻比較 對照組與治療組PS外翻和血小板P-選擇素表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而初發組與其他兩組間的PS外翻和血小板P-選擇素表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3各項指標對T2DM的輔助診斷價值 繪制MPV、AA-PAgTm、ADP-PAgTm、COL-PAgTm、血小板P-選擇素及PS外翻輔助診斷T2DM的ROC曲線，且分別計算各項指標的ROC曲線下面積、cut-off值、靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值，見表3。

表2 3組間血小板參數及PAgTm等指標比較

組別nAA-PAgTm(max,%)ADP-PAgTm(max,%)COL-PAgTm(max,%)血小板P-選擇素(%)PS外翻(%)對照組6063.58±8.2765.27±8.5765.87±9.448.32±1.988.68±2.02治療組6064.07±7.4165.95±8.0067.78±8.158.45±0.929.28±0.82初發組6075.87±4.01*#75.58±5.30*#76.93±6.43*#10.88±1.02*#11.38±1.56*#F62.4736.1831.9863.9352.61P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

表3 各項指標對T2DM的輔助診斷性能比較

3 討 論

血小板主要來源于骨髓成熟的巨核細胞，PLT及MPV反映了骨髓中巨核細胞的增生、代謝及血小板生成情況[3]。有文獻報道，MPV與血小板活性呈正相關[4]，可能是因為新生成的血小板體積較大，含較多致密體，能夠釋出多種內容物，故具有更高的功能活性。范志佳等[5]也綜述了糖尿病患者的大截面血小板是細胞器豐富的大體積血小板，是糖尿病患者血小板高功能活性的主要原因。本研究發現，治療組與初發組患者的MPV均明顯高于對照組，這與已有的大量研究結果一致[3-4]。本研究發現，治療組的PLT與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，本研究結果與李金密等[6]的研究結論一致。但也有研究發現，T2DM患者的PLT較健康對照者明顯升高[7]。此外，也有學者發現，T2DM患者PLT較健康對照者明顯下降[8]。截至目前，關于糖尿病是否會引起PLT的變化及如何變化，尚存在爭議。

本研究結果顯示，各組間PCT無明顯差異，這與趙志勇等[4]的研究結果一致。也有研究者認為PCT在糖尿病患者中明顯升高，且隨糖尿病嚴重程度增加而升高[9]。

有研究發現，糖尿病患者的PDW較健康對照者明顯升高[10-11]，可能與MPV升高引起PDW升高有關。但本研究發現，治療組與對照組PDW并無明顯差異，分析其原因，這都是單中心的研究結論，需要進一步擴大樣本量實施多中心研究來確認PDW與T2DM的相關性。

有研究發現，MPV較大的血小板對誘導劑的聚集反應性也相應增強，更易促進血栓形成，使糖尿病患者發生微血管病變的危險性增加[12]。本研究發現，治療組的PAgTm明顯低于初發組，表明糖尿病患者經過規范化治療后，可引起血小板聚集功能的下降，而血小板高聚集功能與糖尿病患者心腦血管并發癥密切相關[13]。

此外，本研究發現，初發組血小板P-選擇素和PS外翻的水平高于治療組和對照組，而治療組和對照組之間差異并不明顯，說明未經治療的T2DM患者體內血小板的活化和凋亡增加，此結果表明血小板P-選擇素和PS外翻可作為初發糖尿病患者的輔助診斷指標之一，提示早期規范化降糖治療可降低糖尿病患者血小板的聚集活性。因此，及早對糖尿病患者進行規范化治療對延緩心腦血管疾病的發生、發展十分重要，目前臨床對糖尿病患者心腦血管并發癥的監測手段匱乏，本研究發現MPV、PAgTm、血小板P選擇素和PS外翻可以作為T2DM患者是否被規范治療的實驗室評估指標，其中，血小板P-選擇素用來輔助診斷T2DM的靈敏度最高(88.3%)，COL-PAgTm的特異度最佳(91.7%)，而AA-PagTm的診斷效率最優。

綜上所述，本研究發現MPV、PAgTm、血小板P-選擇素和PS外翻在初發未經治療的T2DM中明顯升高，經規范治療后可明顯降低血小板的活化水平，這些實驗室指標可以輔助T2DM的診治，為糖尿病患者心腦血管并發癥的防控提供實驗室數據支撐，值得在臨床上推廣。