苯胺衍生化-高效液相色譜法測定L-乙酰氧基丙酰氯中的乙酰氯

(浙江司太立制藥股份有限公司,臺州 317300)

L-乙酰氧基丙酰氯為無色透明發煙液體,具有強烈的刺激性氣味,腐蝕性強,易與水、醇類化合物等快速反應,它是合成非離子型碘造影劑碘帕醇的重要原料之一[1]。乙酰氯是L-乙酰氧基丙酰氯合成過程中的殘留物,也是合成L-乙酰氧基丙酰氯的原料[2]。乙酰氯會在碘帕醇合成過程中產生乙酰化物雜質,它很難通過精制工藝去除,因此,必須嚴格控制L-乙酰氧基丙酰氯中乙酰氯的含量。

由于未檢索到與乙酰氯測定相關的文獻,考慮到乙酰氯與多氯酰氯相似的化學性質,故可借鑒檢測多氯酰氯的方法來檢測乙酰氯。一般采用化學法測定多氯酰氯的含量[3],也可采用直接進樣-氣相色譜法(GC)[4]測定,但在采用直接進樣-GC測定多氯酰氯時,易出現進樣針、進樣口、色譜柱腐蝕及測定值重現性差等問題。因此,有研究者采用酯化-GC[5-7]和衍生化-GC[8-10]測定多氯酰氯的含量。但采用高效液相色譜法(HPLC)測定多氯酰氯含量的報道較少,也未見其在乙酰氯測定方面的應用。

本工作先用苯胺將乙酰氯衍生化,然后采用HPLC測定L-乙酰氧基丙酰氯中乙酰氯的含量,以期為L-乙酰氧基丙酰氯的質量控制提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器(DAD)和Agilent Open Lab CDS 2.2 工作站。

苯胺溶液:0.6%(體積分數),移取苯胺約0.3 mL于50 mL 容量瓶中,用30%(體積分數,下同)甲醇溶液稀釋至刻度。

乙酰氯對照品儲備溶液:2.40μL·L－1,移取苯胺約0.3 mL于樣品瓶中,再加入乙酰氯24μL,充分振搖后超聲5 min,加入30%甲醇溶液約1 mL,再超聲1 min,轉移至100 mL容量瓶中,用30%甲醇溶液稀釋至刻度;再分取該溶液1.0 mL,用30%甲醇溶液定容至100 mL。

乙酰氯對照品溶液:0.120μL·L－1,移取乙酰氯對照品儲備溶液0.5 mL 于10 mL 容量瓶中,用30%甲醇溶液稀釋至刻度。

乙酰氯標準溶液系列:移取0.5,0.5,1.0,1.5,2.0 mL乙酰氯對照品儲備溶液,用30%甲醇溶液定容至100,20,20,20,20 mL,配制成0.012,0.060,0.120,0.180,0.240μL·L－1的乙酰氯標準溶液系列。

苯胺為分析純;甲醇為色譜純;試驗用水為純水。

L-乙酰氧基丙酰氯供試品批號201707001,由新鄉市金升化工有限公司提供;乙酰氯對照品批號20130222。

1.2 儀器工作條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫30 ℃;流動相為30%甲醇溶液,流量1.0 mL·min－1;檢測波長240 nm;進樣量20μL。

1.3 試驗方法

移取苯胺約0.3 mL 于樣品瓶中,加入L-乙酰氧基丙酰氯供試品70μL,充分振搖后常溫超聲5 min,加入30%甲醇溶液1 mL,再超聲1 min,轉移至50 mL 容量瓶中,用30%甲醇溶液稀釋至刻度;分取該溶液1.0 mL,用30%甲醇溶液定容至10.0 mL,所得溶液即為供試品溶液。按照儀器工作條件測定供試品溶液中乙酰氯的含量。

2 結果與討論

2.1 衍生條件的選擇

苯胺衍生化反應可引入苯環結構,便于后續的紫外檢測器檢測。經過試驗優化,最終確定的衍生化反應條件為常溫超聲5 min,生成的衍生化產物乙酰苯胺的結構見圖1。

圖1 乙酰苯胺的結構Fig.1 Structure of acetanilide

由于乙酰苯胺在酸性或堿性溶液中均易分解,故衍生反應結束后,試驗通過向反應液中加入近中性的30%甲醇溶液來保證衍生產物的穩定。

2.2 檢測波長的選擇

由于乙酰苯胺具有紫外吸收峰的苯環結構,采用DAD 在波長190～400 nm 內對其進行了紫外在線掃描,結果見圖2。

圖2 乙酰苯胺的紫外光譜圖Fig.2 UV spectrum of acetanilide

由圖2可知:乙酰苯胺在241.3 nm 處有最大紫外吸收。因此,試驗選擇的檢測波長為240 nm。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱

試驗比較了十八烷基硅膠柱 VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5μm)和ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)對乙酰苯胺的分離效果。結果顯示:ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)得到的乙酰苯胺的色譜峰峰形及分離效果較好,因此,試驗選擇ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)為分離柱。

2.3.2 流動相

試驗比較了分別以甲醇溶液和乙腈溶液為流動相時乙酰苯胺的分離效果。結果顯示,兩種流動相下得到的乙酰苯胺的分離度均大于2.0。由于甲醇溶液作流動相更常用,因此,試驗選擇甲醇溶液作流動相。

試驗還比較了甲醇溶液的體積分數分別為30%和40%時對乙酰苯胺的分離效果。結果顯示,前者獲得的乙酰苯胺的分離度可以達到2.0以上,故試驗選擇30%甲醇溶液作為流動相。

2.4 專屬性試驗

按照儀器工作條件測定苯胺溶液、乙酰氯對照品溶液、加標供試品溶液(由體積比為1∶20乙酰氯對照品儲備溶液和供試品溶液混合而成),所得結果見圖3。

由圖3可知:衍生化后,產生了乙酰苯胺的色譜峰,其與苯胺的分離度在2.0以上;加標供試品溶液中還出現了L-乙酰氧基丙酰苯胺的色譜峰和樣品中帶來的未知雜質的色譜峰,分離度也均在2.0以上,說明方法的專屬性較好。

圖3 苯胺溶液、乙酰氯對照品溶液、加標供試品溶液的色譜圖Fig.3 Chromatograms of aniline solution,acetyl chloride control solution and spiked test solution

2.5 標準曲線和檢出限

取乙酰氯標準溶液系列,按照試驗方法對其進行衍生化后,按照儀器工作條件測定,以乙酰氯的體積分數為橫坐標,其對應衍生物乙酰苯胺的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,標準曲線的線性范圍為0.012～0.240μL·L－1,線性回歸方程為y＝121.0x＋0.130 1,相關系數為0.999 4。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),所得結果為0.006μL·L－1。

2.6 精密度和回收試驗

按照試驗方法對加標量分別為0.062,0.120,0.180μL·L－1的供試品溶液進行測定,每個加標水平平行測定5次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。結果顯示:3種加標水平下的回收率分別為94.8%,94.2%,92.7%,測定值的RSD 分別為5.5%,8.3%,2.9%。

取同一批樣品,按照試驗方法平行測定6次,所得測定值的RSD 為8.9%。

2.7 樣品分析

按試驗方法分析供試品,檢出乙酰氯在供試品中的體積分數為0.16%。

本工作采用苯胺衍生化-HPLC 測定了L-乙酰氧基丙酰氯中的乙酰氯,本方法衍生化反應快速、回收率高、精密度好,可作為L-乙酰氧基丙酰氯中乙酰氯(雜質)控制的一種可靠的分析方法。