響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪總黃酮的提取工藝研究

陳 港，王 婷，丁小琴，李 欠

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 植物生產(chǎn)類(lèi)國(guó)家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，甘肅蘭州730070）

中藥黃芪是《中國(guó)藥典》[1]中記錄的常見(jiàn)中藥，是蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。現(xiàn)代研究表明：黃芪中主要含有黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)和多糖類(lèi)等化學(xué)成分，具有多種藥理作用[2]。黃芪在中醫(yī)臨床上可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥、嬰幼兒哮喘、脾胃虛寒型消化性潰瘍、胃病等病癥[3-6]，黃芪注射液可用于治療小兒病毒性心肌炎、膿毒癥等病癥[7,8]。同時(shí)，黃芪還研發(fā)了多種具有保健功效的藥品，符合大眾的保健需求[9]。

通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知，黃芪甲苷以及黃芪多糖類(lèi)成分的提取工藝研究較多[10,11]，而黃芪總黃酮的提取工藝研究較少，尤其是結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化的研究更少。近年來(lái)，響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）作為一種非常重要的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，在中藥提取工藝優(yōu)化等方面得到廣泛的應(yīng)用。響應(yīng)面法是將影響提取試驗(yàn)結(jié)果的因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后按照設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)得到試驗(yàn)結(jié)果。分析試驗(yàn)因素和試驗(yàn)結(jié)果之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，進(jìn)而得到最優(yōu)的試驗(yàn)條件[12]。本文以黃芪中總黃酮的提取率為指標(biāo)，采用超聲提取的方法，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪總黃酮的提取工藝，最終得到最佳的提取條件。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 藥材

黃芪藥材購(gòu)自黃河藥材市場(chǎng)（產(chǎn)地甘肅），并經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥學(xué)教研室邱黛玉副教授鑒定為蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mon gholicus（Bge.）Hsiao]。

1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品（純度：98%），氫氧化鈉、亞硝酸鈉和硝酸鋁均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

超聲波提取儀、電子天平、真空泵、實(shí)驗(yàn)旋渦混合器和紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本試驗(yàn)采用呂鳳嬌[13]等人的方法，首先精密稱(chēng)取10 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于容量瓶中，加入30%的乙醇準(zhǔn)確定容于50 ml 的容量瓶中，得到濃度為0.2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。依次緩慢吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml 置于10 ml 的容量瓶中，以下操作均以移液槍進(jìn)行，以減少試驗(yàn)誤差，首先吸取的5%NaNO2溶液0.3 ml，震蕩均勻，靜置6 min，使溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)，再吸取10%Al（NO3）3溶液0.3 ml，震蕩均勻，靜置6 min，再吸取4%NaOH 溶液4.0 ml 震蕩搖勻后靜置15 min，最后用30%的乙醇定容，在波長(zhǎng)510 nm 處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，同樣用30%的乙醇溶液作對(duì)比，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度C（mg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸[13]。

2.2 供試品溶液制備

稱(chēng)取1 g 左右的黃芪粉末，倒入提前洗干凈并且烘干的錐形瓶中，按照不同的乙醇濃度、不同的液料比、不同的提取時(shí)間相同溫度每3 個(gè)錐形瓶為1組進(jìn)行超聲提取，然后進(jìn)行抽濾，收集濾液，按照順序放在陰涼處備用。

2.3 黃芪中黃酮的含量測(cè)定

采用呂鳳嬌[13]等人的方法測(cè)定黃酮含量，吸取5 ml 上述一定試驗(yàn)條件下超聲提取得到的供試品溶液置于10 ml 的容量瓶中，待測(cè)液配制方法同2.1，同樣在波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光值。提取率按下式計(jì)算：

式中，R 為提取率，C 為黃芪中總黃酮的濃度，單位是mg/ml，n 為稀釋倍數(shù)。

2.4 優(yōu)化黃芪總黃酮提取工藝

2.4.1 黃芪中總黃酮提取工藝單因素考察 如表1 所示，每個(gè)試驗(yàn)水平條件下設(shè)3 個(gè)平行組，進(jìn)行考察。

表1 單因素試驗(yàn)

2.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪中總黃酮提取工藝試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響提取結(jié)果的3 個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黃芪中總黃酮的提取率（R）為響應(yīng)值（見(jiàn)表2）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

根據(jù)上述“2.1”項(xiàng)下的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而確定對(duì)照品濃度與吸光度之間的關(guān)系，A=12.69C－0.018 6，R2=0.999 3，結(jié)果表明：吸光度與濃度具有良好的線性相關(guān)關(guān)系，線性范圍為0.02～0.12 mg/ml。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 為乙醇濃度對(duì)黃芪總黃酮提取率的影響，從圖1 可以看出，乙醇濃度65%，提取率最大。圖2為提取時(shí)間對(duì)黃芪總黃酮提取率的影響，從圖2 可以看出，提取時(shí)間為40 min 時(shí)，提取率最大。圖3 為液料比對(duì)黃芪總黃酮提取率的影響，從圖3 可以看出，液料比為15 時(shí)，提取率最大。

圖1 乙醇濃度對(duì)黃芪總黃酮提取率的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)黃芪總黃酮提取率的影響

圖3 液料比對(duì)黃芪總黃酮提取率的影響

3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪中總黃酮試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)上述表2 試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表3 所示。

3.3.2 模型顯著性分析 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣利用軟件得到二次多項(xiàng)式回歸方程，R=0.14+0.00575A+0.00275B-0.00375C-0.0005AB-0.01AC+BC-0.017 A2-0.014 B2-0.022 C2，決定系數(shù)（r2）=0.978 4，調(diào)整系數(shù)為0.950 7。表4 為方差分析結(jié)果，由方差結(jié)果可知，本試驗(yàn)所建立的模型具有極強(qiáng)顯著性，而失擬項(xiàng)不具有顯著性（P=0.458 5）。由回歸方程可以看出，2 次項(xiàng)乙醇濃度A2、提取時(shí)間C2有極強(qiáng)的顯著性，2 次項(xiàng)液料比B2為一般顯著項(xiàng)，其他為不顯著項(xiàng)。分析原因：一是做實(shí)驗(yàn)過(guò)程中提取溫度沒(méi)有控制相同，沒(méi)有及時(shí)用溫度計(jì)測(cè)量溫度，導(dǎo)致最后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響；二是抽濾過(guò)程操作不夠規(guī)范，導(dǎo)致供試液有誤差；三是實(shí)驗(yàn)之前文獻(xiàn)的查閱不夠全面，最開(kāi)始的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)置梯度有問(wèn)題，導(dǎo)致最后響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有誤差。因此，乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響最大，提取時(shí)間對(duì)提取率影響次之，液料比對(duì)提取率影響較小。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

3.3.3 最佳提取工藝參數(shù)預(yù)測(cè) 首先，響應(yīng)面的傾斜程度反應(yīng)的是3 個(gè)因素（乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間）對(duì)響應(yīng)值（提取率）的影響程度，若坡度越陡，則因素間交互作用越顯著。其次，曲面圖的顏色反映的是因素間的變化趨勢(shì)，若顏色越深，則變化趨勢(shì)越明顯，結(jié)果如圖4。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明：黃芪中總黃酮最優(yōu)的提取工藝參數(shù)為乙醇濃度66.02%，液料比15.47，提取時(shí)間38.69 min。在這個(gè)條件下，黃芪中總黃酮的提取率為0.136 4%。

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

在實(shí)際實(shí)驗(yàn)時(shí)，要重點(diǎn)考慮實(shí)際操作的可行性以及驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以將工藝參數(shù)人為調(diào)整：乙醇濃度66%，液料比15，提取時(shí)間37 min，同樣的條件，做3 次重復(fù)試驗(yàn)，降低試驗(yàn)的誤差，并且對(duì)最后結(jié)果求平均值，得到總黃酮的提取率為0.135%，與預(yù)測(cè)值0.136 4%僅僅相差了0.001 4 個(gè)百分點(diǎn)，表明該工藝參數(shù)下，提取率達(dá)到了最大值，經(jīng)本試驗(yàn)優(yōu)化后的提取工藝更加準(zhǔn)確、可靠。

3.5 方法學(xué)考察

3.5.1 精密度考察 為了測(cè)定分光光度計(jì)的精密度，選取一份供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6 次吸光度，計(jì)算其RSD 值，本實(shí)驗(yàn)RSD 為1.01%，表明儀器具有良好精密度，可以用于實(shí)驗(yàn)。

3.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 為了考察本實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性，同一條件下準(zhǔn)備6 份供試品溶液，測(cè)定其吸光度，計(jì)算其RSD 為0.98%，表明本方法具有良好的重現(xiàn)性。

3.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1 份供試品溶液在0～12 h（間隔2 h）測(cè)定其吸光度的變化以考察其穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)RSD 為1.67%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以超聲輔助響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪中總黃酮的最佳提取工藝為目的。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，再通過(guò)Box-Behnken 響應(yīng)面法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合優(yōu)化得到其最佳提取工藝。最后按照最佳的提取工藝做了3 組重復(fù)試驗(yàn)，證明了工藝的可靠性。在響應(yīng)面法的優(yōu)化下，黃芪中總黃酮的提取工藝更為充分、準(zhǔn)確，可用于黃芪中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取的工藝研究和質(zhì)量評(píng)價(jià)。

表4 方差分析

圖4 黃芪黃酮提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面圖