甲苯磺酸索拉非尼片微生物限度檢查方法研究

張春華，劉緒平，鄧維，章瑛

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

甲苯磺酸索拉非尼片，商品名為多吉美（Nexavar）為多靶點抗腫瘤藥，臨床上主要用于不能手術的晚期腎細胞癌以及無法手術或遠處轉移的肝細胞癌。其對原發性肝癌治療效果好，可延遲病灶進展、改善生存質量和健康水平，且降低不良影響的發生率［2-6］。最常見的不良反應為胃腸道反應和血小板降低及手足皮膚反應［7-10］，為預防患者用藥時帶來一些安全隱患，本研究根據《中國藥典》2015 年版四部的要求對其進行了微生物限度計數方法研究，建立了甲苯磺酸索拉非尼片的微生物限度檢查方法［1］，且檢驗效果良好。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

電子天平Quintix6101-1CN；生物安全柜13844'BSC賽默飛；細菌培養箱SPL-250；霉菌培養箱3758CN；集菌儀；恒溫震蕩器。

1.2 培養基

所用培養基適用性均符合《中國藥典》2015 年版四部的要求，見表1。

表1 培養基信息

1.3 試驗菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），CMCC（B）10104；大腸埃希菌（Escherichia coli），CMCC（B）44102；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），CMCC（B）63501；黑曲霉（Aspergillus niger），CMCC（F）98003；白色念珠菌（Candida albicans），CMCC（F）98001。菌種均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 樣品

甲苯磺酸索拉非尼片，江西山香藥業有限公司，規格：0.2 g，批號：180501。

2 方法

2.1 菌液的制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌分別接種于適量的TSB 中，經33 ℃培養24 h 后，取新鮮培養物1 mL，用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液10 倍稀釋至10-3～10-7。

取黑曲霉接種至SDA 斜面上，經23 ℃培養1周后，取新鮮培養物用3 mL～5 mL 含0.05%吐溫80 的0.9%無菌氧化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1 mL，加上述稀釋劑適量稀釋，用標準比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，取1 mL 稀釋后的孢子懸液，用上述稀釋劑10 倍稀釋至10-2～10-4。

取白色念珠菌接種于適量的SDA 中，經23 ℃培養3 d 后，取新鮮培養物1 mL，用pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液10 倍稀釋至10-2～10-4。

上述試驗菌株均為第2 代菌。

2.2 樣品的制備

取本品10 g，放置無菌的錐形瓶中，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，恒溫振搖5 min，作為1∶10 供試液。

2.3 方法驗證

2.3.1 預實驗選用金黃色葡萄球菌（需氧菌）、白色念珠菌（真菌）作為敏感菌株進行預試驗，結果詳見表2 和表3。

表2 金黃色葡萄球菌預試驗的結果

表3 白色念珠菌預試驗的結果

上述結果表明，甲苯磺酸索拉非尼片對需氧菌具有抑制作用，而對霉菌和酵母菌沒有抑制作用，根據預試驗的結果，初步確定采用薄膜過濾法（1∶10的供試液1 mL，沖洗300 mL）進行需氧菌總數計數，采用平皿法（1∶10 的供試液）進行霉菌和酵母菌總數計數。

2.3.2 微生物計數方法的適用性試驗適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液抽入濾器中，然后取上述制備好的1∶10 供試液1 mL，混勻，全部通過濾膜，再用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL沖洗，每次100 mL/筒，沖洗3 次，在最后一次沖洗液中加入試驗菌（≤100 cfu），濾干，立即貼膜于預制好的TSA 平板上，作為需氧菌總數計數法檢查。

取6 支試管，4 支試管分別加入上述制備好的1∶10 供試液9.9 mL 和2 支試管加入pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL，再加入適宜濃度的試驗菌液0.1 mL，混勻，作為試驗組和菌液對照組。分別取注入平皿，測定霉菌和酵母菌總數。

取上述制備好的1∶10 供試液和相應稀釋液替代供試液同試驗組操作，測定供試品對照組菌落數和菌液組菌落數。

需氧菌總數選用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌（置33 ℃培養箱培養24 h～72 h）白色念珠菌和黑曲霉（置33 ℃培養箱培養24 h～120 h），霉菌和酵母菌總數選用白色念珠菌和黑曲霉（置23 ℃培養箱培養2 h～120 h），均需逐日觀察結果。結果均符合要求，見表4。

表4 微生物計數方法適用性試驗結果

回收比值=（供試品試驗組菌落數－供試品對照組菌落數）÷菌液組菌落數

2.3.3 控制菌檢查方法適用性試驗 取上述制備好的1∶10 供試液10 mL 加入100 mL TSB 中，同時加入小于100 cfu 的大腸埃希菌液，混勻后，培養18 h 后，取培養物1 mL 接種至100 mL MACB 中，置42 ℃培養24 h 后，取MACB 增菌液劃線接種于MACA平板上，置33 ℃培養72 h 后，取MACA 平板上菌落經純化后的培養物，接種至含5 mL MUG 培養基的試管內，同時用未接種的MUG 培養基作本底對照。置33 ℃培養，于5 h、24 h 在366 nm 紫外線下觀察，取稀釋液10 mL 照上述方法操作，作為陰性對照組。

試驗組的 MUG-I 呈現藍白色熒光，觀察后，沿管壁加入數滴靛基質試液，試驗組的MUG-I 液面呈玫瑰紅色，試驗呈陽性，檢出大腸埃希菌；陰性對照組的 MUG-I 未呈熒光，試驗呈陰性，未檢出大腸埃希菌。

3 討論

在進行供試品計數方法驗證時，根據樣品的成分和性質判斷，選擇對供試品可能敏感的菌株進行試驗，從預實驗的結果建立樣品的微生物計數方法。綜合上述研究結果顯示，甲苯磺酸索拉非尼片具有一定的抑菌作用，尤其是對于細菌抑菌性較強，若采取平皿法，會導致試驗結果的回收效果不理想。為了研究微生物限度檢查方法的成效，按照藥典要求對甲苯磺酸索拉非尼片微生物限度檢查進行研究，所實驗的各試驗菌其回收比值符合藥典規定，試驗方法可用于甲苯磺酸索拉非尼片的微生物限度檢查。