烏司他丁對創傷失血性休克大鼠肺炎癥介質及其信號通路miR-146a調控TLR4/NF-κB的影響研究

應盼　　吳先龍　　楊志輝　　辛文偉

[摘要] 目的 探討烏司他丁對創傷失血性休克大鼠肺炎癥介質及其信號通路miR-146a/TLR4/NF-κB的影響。 方法 將60只SD大鼠經股動脈放血制作休克模型，采用隨機數字表法分為A、B、C三組，每組20只，其中A組不予復蘇，B組休克后60 min給予醋酸鈉林格液復蘇，C組采用醋酸鈉林格液聯合烏司他丁復蘇。采集大鼠復蘇后肺組織，對肺組織中miR-146a、TNF-α、IL-1、IL-4、IL-6以及IL-10的mRNA水平予以檢測，采用Western blotting對肺組織中TLR4、NF-κB蛋白相對表達量予以檢測，對三組大鼠肺組織病理學變化予以觀察。 結果 與A組、B組相比，C組大鼠miR-146a、IL-4、IL-10 mRNA水平提高，TNF-α、IL-1、IL-6水平下降，差異有統計學意義（P<0.05）;三組大鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平相比，C組低于A組、B組，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 烏司他丁能夠通過增強miR-146a表達復蘇創傷失血性休克大鼠，對TLR4/NF-κB信號通路起到負反饋調控作用，維持促炎因子與抑炎因子平衡，對肺組織具有保護作用。

[關鍵詞] 烏司他丁;創傷失血性休克大鼠;炎癥介質; miR-146a;TLR4/NF-κB通路

[中圖分類號] R392.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）10-0031-05

Research on the impacts of ulinastatin on the regulation of TLR4/NF-κB by pulmonary inflammatory mediators and the signaling pathway of miR-146a in rats with traumatic hemorrhagic shock

YING Pan? ?WU Xianlong? ?YANG Zhihui? ?XIN Wenwei

Department of Emergency， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou 318020， China

[Abstract] Objective To investigate the impacts of ulinastatin on miR-146a/TLR4/NF-κB by pulmonary inflammatory mediators and the signaling pathway in rats with traumatic hemorrhagic shock. Methods A total of 60 SD rats were subjected to femoral artery bloodletting to establish shock models， and they were randomly divided into group A（n=20）， group B （n=20） and group C （n=20）. Among which， group A was not resuscitated， group B was resuscitated with sodium acetate Ringer solution 60 min after shock，and group C was resuscitated with sodium acetate Ringer solution combined with ulinastatin. The mRNA contents of miR-146a， TNF-α， IL-1， IL-4， IL-6 and IL-10 in the lung tissue of rats after resuscitation were detected. The relative expression of TLR4 and NF-κB protein in the lung tissue was detected by Western blotting， and the pathological changes of lung tissues of the three groups of rats were observed. Results Compared with group A and group B， the mRNA indexes of miR-146a， IL-4 and IL-10 in group C were increased， while the levels of TNF-α， IL-1 and IL-6 were decreased， with statistically significant differences （P<0.05）. Compared with group A and group B， TLR4 and NF-κB protein expression levels in group C were significantly lower than those in group A and group B， with statistically significant differences（P<0.05）. Conclusion Ulinastatin can resuscitate rats with traumatic hemorrhagic shock by enhancing the expression of miR-146a， play a negative feedback regulation role in TLR4/NF-κB signaling pathway，maintain the balance between pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors，and have protective efficacy on lung tissue.

[Key words] Ulinastatin; Rats with traumatic hemorrhagic shock; Inflammatory mediators; miR-146a; TLR4/NF-κB pathway

作為臨床常見的危重癥，創傷失血性休克主要是指創傷引起的機體大量失血、血容量降低、細胞代謝失調等病理現象，起病急、病情進展速度快，主要臨床特點如下：①失血過多。失血是創傷性休克最常見的原因，因體內血液大量流失，就會導致全身的組織和器官缺氧。②患者機體組織遭到破壞。受到嚴重擠壓就會導致患者組織出現缺血和壞死，從而引起休克。③細菌影響。患者受到創傷后就會出現細菌感染，而細菌又會產生很多的毒素，從而進入血液中，使患者出現休克。④神經內分泌紊亂。受到嚴重創傷后的患者會出現很多的癥狀，而這些癥狀又會導致中樞神經受到刺激，從而引發休克。若治療不及時或治療方案不當，將會導致機體微循環功能紊亂，威脅患者生命安全。

流行病學調查研究發現，創傷失血性休克死亡率高，主要與未能及時有效控制失血誘發的一系列炎癥反應有關[1]。臨床強調針對創傷失血性休克應積極改善微循環、控制失血、抑制炎癥因子，以實現對患者病情的控制，防止全身炎癥反應，挽救患者生命安全[2]。目前，國內外關于創傷失血性休克限制液體復蘇及信號通路以減輕炎癥反應報道較少，關于miR-146a表達是否參與肺組織炎癥損傷調控尚不明確。作為液體復蘇常用晶體液，醋酸鈉林格液主要成分包括鈉、鉀、氯等，且離子濃度接近于血漿，在維持機體水電解質平衡、緩解組織損傷、擴容方面有著重要的作用[3]。作為尿胰蛋白酶抑制劑，烏司他丁具有免疫調節、平衡炎癥作用，在胰腺炎、膿毒癥等休克疾病診斷中已得到廣泛應用[4]。失血性休克會對肺組織產生一定的損傷，同時也是最先累及的器官，因此從miR-146a/TLR4/NF-κB 信號通路方向，烏司他丁影響創傷休克大鼠肺部炎癥機制切實可行。本研究選擇60只大鼠構建創傷失血性休克模型，旨在分析烏司他丁對大鼠肺炎癥介質及其信號通路miR-146a/TLR4/NF-κB的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物

60只健康SD大鼠購自南京君科生物科技有限公司，批號： SCXK 20090002，雌雄不限，體重210～280 g，平均（240±15）g;鼠齡6～9周，平均（7.31±0.33）周。將室溫控制在25℃左右，濕度以40%～60%為宜。自清晨7：00至下午7：00實施12 h光照與黑暗周期交替，在該環境下飼養1周后進行實驗。大鼠食物選擇顆粒狀，飲水隨意。于上午7：00建立創傷失血性休克模型，嚴格按照醫學實驗動物護理及使用指南完成相關操作，經實驗動物管理批準，符合醫院醫學倫理標準。

1.2 設備及試劑

采用生物信號采集處理系統medlab（南京卡爾文生物科技有限公司）;MH3180R高速冷凍離心機（長沙綜儀生物科技有限公司）;美國伯樂bio-rad核酸蛋白測定儀SmartSpec Plus（上海蘊策生物有限公司）;Thermofisher 實時熒光定量PCR儀購自科至達（北京）信息技術有限公司;烏司他丁（常州天普制藥有限公司，國藥準字H19990131）;醋酸鈉林格液（湖北多瑞藥業有限公司，國藥準字H20100138）。

1.3分組及模型建立

將60只大鼠隨機分為三組，每組各20只。A組休克不復蘇，B組給予醋酸鈉林格液，C組給予醋酸鈉林格液聯合烏司他丁。三組大鼠鼠齡及體重比較，差異無統計學意義（P>0.05）。①休克模型構建：首先對大鼠進行稱重，然后給予戊巴比妥鈉50.25 mL/100 g（上海新亞藥業有限公司，國藥準字H31020240）、異氟醚1.0 mL/kg（河北一品制藥股份有限公司，國藥準字H19980141）腹腔注射進行麻醉，完成麻醉后，在手術臺上將大鼠擺為仰臥位并予以固定，常規備皮、消毒、鋪巾，將大鼠兩側腹股溝位置皮膚切開，對股動脈、股靜脈進行鈍性游離，置管并妥善固定，在其中注入枸櫞酸鈉注射液，確保管腔無堵塞，選擇置于右側股動脈的導管與生物信號采集系統連接，監測大鼠MAP。選擇右側股靜脈完成液體復蘇相關操作，左側股動脈則建立休克模型，并將其連接微量泵。控制適宜的手術室溫度，以25℃為宜。②復蘇模型構建：完成置管后，靜置20 min，采用2 mL注射器按照2 mL/min的速率從股動脈緩慢放血，直至血壓維持在30～40 mmHg。回血采用緩慢、間斷的方式，維持MAP在30～40 mmHg。60 min后A組不實施液體復蘇，于左側股靜脈推注2 mL生理鹽水，5 min內完成;B組休克后60 min右側股靜脈給予醋酸鈉林格液輸入;C組采用醋酸鈉林格液聯合烏司他丁復蘇，選擇左側股靜脈給予100 000 U/kg烏司他丁靜脈推注，醋酸鈉林格液500 mL/次。復蘇后提取大鼠肺組織。實驗期間采用微量泵經左側股靜脈泵入5 mL生理鹽水。

1.4 肺組織炎癥指標檢測

提取肺組織標本后，按照要求完成總RNA分離及提取操作，所用方法為Trizol法，使其成為cDNA，實施qPCR擴增處理。擴增引物選擇的是GAPDH，條件設置參照以往條件。預變性處理設置為95℃ 1 min;變性處理條件設置為95℃ 15 s，延伸條件為60℃ 30 s，循環次數為40次。繪制溶解曲線。完成反應后，對Ct值予以讀取，對mRNA表達量予以計算。

1.5肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達

肺組織標本選擇100 mg予以2～3次PBS沖洗，然后將其置于勻漿管壺腹部，剪碎，加入裂解液，在冰上進行研磨處理。提取肺組織蛋白，以12 000 r/min離心速率在4℃環境下實施離心處理，時間以10 min為宜，提取上清液，按照BCA蛋白質定量試劑盒分析蛋白質，并對蛋白濃度予以檢測。實施SDS-PAGE凝膠電泳處理，使其成為PVDF膜。放置5%脫脂奶粉封閉液2 h 于搖床，添加一抗，設置溫度為4℃，過夜。二抗加入前應實施3次TBST洗滌，孵育1 h，再次進行3次TBST洗滌膜。在暗室環境下經曝光、顯影獲得膠片，采用化學發光法檢測蛋白相對表達量。

1.6 Western blotting檢測

提取凍存的肺組織，經裂解處理收集勻漿，對組織蛋白濃度予以檢測。然后實施電泳，其操作同1.5。孵育一抗anti-body由愛必信（上海）生物科技有限公司提供，二抗（酶標記-常用HRP）由上海瑞齊生物科技有限公司提供。再次洗滌膜。膜上條帶密度采用化學發光法進行掃描，獲得目標蛋白表達量。

1.7觀察指標及評價標準

采用Western blotting對肺組織中TLR4、NF-κB蛋白相對表達量予以檢測，對三組大鼠肺組織病理學變化予以觀察。肺組織經固定、包埋及切片相關操作后，行HE染色，對其在光鏡下的表現及變化予以觀察，并做好相應的記錄。

1.8 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗;符合正態分布的計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠肺組織炎癥指標表達情況

在三組大鼠IL-4、IL-10以及miR-146a指標中C組最高，在促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6水平表達中C組最低，三組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2三組大鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達比較

C組大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達量明顯低于A組、B組，差異有統計學意義（P<0.05），A組TLR4、NF-κB蛋白表達量明顯高于B組，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3三組肺組織病理學改變情況

光鏡下觀察大鼠肺組織發現，A組存在腎小管明顯擴張，伴隨脫落及壞死細胞、上皮細胞腫脹，間質間有浸潤炎癥細胞;B組上皮細胞腫脹較輕，腎小管管腔擴張輕于A組，間質有散在炎癥細胞;C組炎癥減輕明顯，僅存在零落炎癥細胞。見封三圖1。

3 討論

創傷失血性休克病情急、死亡率高，對患者重要臟器產生直接損傷，當觸及炎癥瀑布樣釋放后，會加重免疫炎癥調控系統紊亂，引起組織器官損傷。隨著現代醫療衛生技術的進步，創傷失血性休克死亡率顯著降低，但發病率居高不下，若處理不及時將會累及全身多個器官，誘發患者死亡[5-6]。針對創傷失血性休克多強調改善組織灌注，對機體炎癥水平予以調節，防止造成不可逆損傷。本研究在限制性液體復蘇基礎上聯合烏司他丁，與失血性休克救治理念相符。本研究肺組織病理結果顯示，A組肺組織損傷最為嚴重，其次為B組，肺組織損傷程度最輕、改善最為明顯的則是經烏司他丁干預的C組。

微循環障礙很大程度上是由于炎癥介質的參與，與此同時，創傷應激也與炎癥反應密切相關，當伴隨失血性休克時會引起IL-1、IL-6以及TNF-α促炎因子釋放[7]。作為抑炎因子，IL-4、IL-10表達增強可對促炎因子生成起到抑制作用，能夠起到平衡炎癥的作用，是肺組織的重要保護性因子。烏司他丁既往證實在胰腺炎患者機體中可對TNF-α、IL-6產生抑制，提高IL-10水平，提示該藥物治療膿毒癥休克及胰腺炎可以改善炎癥癥狀，發揮保護肺組織的作用[8]。本研究隨訪了不同組大鼠復蘇后促炎因子及抑炎因子變化情況，結果顯示采用烏司他丁與醋酸鈉林格液聯合復蘇干預的C組大鼠miR-146a、IL-4、IL-10的mRNA水平升高，TNF-α、IL-1、IL-6水平下降，與A組、B組比較，差異有統計學意義（P<0.05），提示烏司他丁能夠對促炎因子釋放起到抑制作用，同時可刺激抑炎因子表達，在緩解肺組織炎癥損傷方面具有顯著的作用。miR-146a因其能夠負向調節核因子κB（Nuclear factor κB，NF-κB）信號通路，在控制炎癥反應及免疫調節中扮演重要角色，從而得到眾多學者的關注[9-11]。以往研究發現，miR-146a同樣可以通過不同的分子機制影響骨髓造血穩態的維持及腫瘤形成[12]。miR-146a調控下游基因表達的多樣性和復雜性，反映了其可參與機體多個生物過程，發揮著重要的生物學作用。而miR-146a在不同疾病模型中表達水平各異，所介導的信號通路和所造成的最終結局也不盡相同[13-15]。臨床實驗表明，miR-146a能夠通過對促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α釋放的抑制，發揮保護肺組織的作用[16-17]，可緩解創傷帶來的炎癥疼痛。合并缺血再灌注損傷則往往伴隨miR-146a表達代償性提高，使得NF-κB表達降低，IL-1、IL-6等促炎因子釋放也會受到一定的抑制，提示機體缺血再灌注損傷治療靶點可能為miR-146a，其過度表達會促進IL-6水平下降，通過對IL-10的抑制，誘導miR-146a表達[18]。TLR4活化會對TNF-α產生影響，TNF-α經活化作用會促進NF-κB轉錄活性增強。創傷失血性休克通過對機體信號通路的觸發可刺激炎癥介質釋放，信號通路與炎癥介質是相互影響的關系，但具體關系尚未得到證實[19]。本研究結果顯示，C組miR-146a、IL-4、IL-10的mRNA水平升高，TNF-α、IL-1、IL-6水平下降，與A組、B組比較，差異有統計學意義（P<0.05），三組大鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平相比，C組最低，差異有統計學意義（P<0.05），提示烏司他丁通過對miR-146a的影響，對下游炎癥因子表達起到調控作用，并對TLR4/NF-κB信號通路活化起到抑制作用，降低促炎因子水平，緩解肺組織損傷[20]。但基于miR-146a信號通路復雜性，其還需要大量的研究及數據支持，兩者是否為因果關系，是否通過miR-146a進行調控，需要用細胞模型及RNA干擾等試驗進一步驗證。

綜上所述，烏司他丁應用于創傷失血性休克大鼠可抑制miR-146a表達，抑制TLR4/NF-κB信號通路活化，緩解肺部炎癥反應，可為烏司他丁臨床應用提供理論依據。

[參考文獻]

[1] 張蕾，李文瀾，賈一帆，等.烏司他丁對失血性休克大鼠肺組織損傷的保護作用[J].現代藥物與臨床，2019，34（2）：276-280.

[2] 王振杰，陳硬，宋琦，等.烏司他丁通過miR-146a調節TLR4/NF-κB信號通路減輕失血性休克大鼠腎炎癥損傷研究[J].蚌埠醫學院學報，2020，45（3）：286-290，295.

[3] 姜遠旭，夏明珠，丁登峰，等.烏司他丁對失血性休克/復蘇-內毒素雙重打擊大鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國急救醫學，2016，36（12）：1116-1120，后插2.

[4] Lee JH，Jeon YD，Lee YM，et al.The suppressive effect of puerarin on atopic dermatitis-like skin lesions through regulation of inflammatory mediators in vitro and in vivo[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2018，498（4）：258-260.

[5] 徐志鵬，陳硬，宋琦， 等.醋酸鈉林格液聯合烏司他丁對失血性休克大鼠肝組織NF-κB p65蛋白表達及其細胞因子的影響[J].蚌埠醫學院學報，2018，43（10）：1334-1338.

[6] 王兮，母前途，馮思嘉.基于TLR4/MyD88/NF-κB通路探討烏司他丁減輕脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷的作用[J].河北醫學，2019，25（8）：1299-1304.

[7] Liu HX，Wang ES，Lin YM，et al.Neuroprotective effect of docosahexaenoic acid in rat traumatic brain injury model via regulation of TLR4/NF-Kappa B signaling pathway[J].The International Journal of Biochemistry and Cell Biology，2018，99（26）：64-71.

[8] 陸貝，于源泉，殷俊杰，等.過氧化物酶體增殖物激活受體-γ激動劑對急性胰腺炎大鼠肺損傷的保護機制研究[J].中國現代醫生，2017，55（18）：38-41.

[9] 丁峰，劉曉萍.烏司他丁聯合葛根素對大鼠急性肺損傷模型Toll樣受體4表達的影響[J].中國臨床藥理學雜志，2018，34（11）：1342-1344，1360.

[10] Eman Al-Sayed， Gad HA， Mohamed El-Shazly，et al.Anti-inflammatory and analgesic activities of cupressuflavone from cupressus macrocarpa：Impact on pro-inflammatory mediators[J].Drug Development Research，2018， 79（1）：205-208.

[11] 郎志斌，范曉珍，林洪啟，等.烏司他丁預先給藥對體外循環大鼠急性肺損傷時AQP1和AQP5表達的影響[J].中華麻醉學雜志，2018，38（10）：1261-1265.

[12] Kaki A，Nikbakht M，Habibi AH， et al. Effect of aerobic exercise on innate immune responses and inflammatory mediators in the spinal cord of diabetic rats[J]. Comparative Exercise Physiology，2020，16（4）：1-10.

[13] 黃志剛，郭光偉，常亮，等.烏司他丁聯合利多卡因對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國現代醫生，2012，50（33）：24-26.

[14] 王靜，黃忠，魏尉，等.HMGB1在重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷中的表達及烏司他丁的干預效應[J].西部醫學，2018，30（2）：174-177.

[15] 陶廣華，劉向六，羅偉，等.右美托咪定聯合烏司他丁對大鼠呼吸機相關性肺損傷的保護作用及機制[J].現代中西醫結合雜志，2018，27（3）：240-244，298.

[16] 徐建安，李王安.烏司他丁治療創傷失血性休克后多器官功能衰竭的效果[J].黑龍江醫藥，2019，32（6）：1267-1269.

[17] 李敏，劉曉田，謝云斌，等.CaN/NFATc4信號通路在VILI大鼠肺組織炎癥反應中的作用[J].中華麻醉學雜志，2019，39（6）：761-764.

[18] 程中貴，孫楊.烏司他丁對失血性休克/復蘇患者肺損傷的保護作用的研究[J].江西醫藥，2019，54（5）：540-542.

[19] 陳榮琳，曹楓，符少平，等.CD200調節重癥中暑大鼠肺部炎癥反應的信號通路初探[J].解放軍醫學雜志，2020， 45（3）：265-269.

[20] 彭官清，凌喬，余舒瑩.miRNA-155對重癥肺炎大鼠肺組織的保護作用及機制[J].重慶醫學，2019，48（17）：2890-2894.

（收稿日期：2020-11-24）