水蒸氣蒸餾與頂空進(jìn)樣GC-MS法分析細(xì)辛揮發(fā)性成分*

王維 ，賈曉華 ，高夢園 ，歐陽慧子 ，何俊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag.、漢城細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai或華細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.的干燥根和根莖。細(xì)辛作為中藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為馬兜鈴科細(xì)辛屬多年生草本植物，其性溫味辛，歸心、肺、腎經(jīng)，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、通竅、溫肺化飲等功效，主治風(fēng)寒感冒、頭痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、風(fēng)濕痹痛、痰飲喘咳等癥[1-2]。

細(xì)辛的化學(xué)成分有揮發(fā)油類、黃酮類、木脂素類、生物堿及酰胺類、有機酸類、氨基酸類化合物等[3]，其中揮發(fā)油類化合物是細(xì)辛中的一類重要成分，具有較強的藥理活性。現(xiàn)代研究表明細(xì)辛揮發(fā)油具有解熱，鎮(zhèn)痛，鎮(zhèn)靜，催眠，抗驚厥，局部麻醉，強心，抗炎，抗菌[4-9]等多種藥理作用。為了更加全面地了解細(xì)辛中的揮發(fā)性成分，本實驗分別采用水蒸氣蒸餾法和頂空進(jìn)樣法從細(xì)辛中提取揮發(fā)油，并采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）的分析方法對兩種不同提取方法獲得的細(xì)辛揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析與比較，為細(xì)辛揮發(fā)性成分的研究和開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

儀器：GCMS-QP2010 Ultra型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本Shimadzu公司）；Shimadzu GCMSsolution工作站（日本Shimadzu公司）；AS 60/220.R2型十萬分之一天平（波蘭RADWAG公司）；Milli-Q超純水制備儀（Millipore公司）；G3KT18273型旋渦混合器（賽默飛世爾科技公司）；5424 R型高速控溫離心機（Eppendorf公司）；ZZ-L6DT超聲波清洗機。

試劑：正己烷（色譜純）購自天津市康科德科技有限公司。

藥材：細(xì)辛產(chǎn)自遼寧省鐵西市，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)何俊研究員鑒定其基原為北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag.的干燥根和根莖。藥材經(jīng)粉碎后，過3號篩，保存于天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院。

2 方法

2.1 揮發(fā)性成分的提取 水蒸氣蒸餾法：精密稱取50.0 g剪碎的細(xì)辛藥材，置燒瓶中，加水400 mL與數(shù)粒玻璃珠，振搖混合后，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時為止。置電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸6 h，至測定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將水緩緩放出，收集上層細(xì)辛揮發(fā)油。實驗得到淺綠色透明具有特殊濃郁氣味的油狀液體，以無水硫酸鈉干燥，得油率為1.4%。取所得到的揮發(fā)油1 μL，置于10 mL容量瓶，加正己烷定容至刻度，渦旋混勻即得，4°C冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

頂空進(jìn)樣：精密稱取1.0 g細(xì)辛藥材（經(jīng)粉碎），置于20 mL頂空瓶中，橡膠密封墊及鋁蓋封口，放入頂空進(jìn)樣器中按頂空進(jìn)樣條件進(jìn)樣分析。頂空進(jìn)樣條件：樣品平衡溫度100℃，平衡時間20 min，定量管溫度120℃，傳輸線溫度140℃，載氣為高純氦氣，加壓時間0.1 min，進(jìn)樣時間1 min。

2.2 GC-MS分析條件 色譜條件：色譜柱DB-17毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣，柱流量為1.3 mL/min。升溫程序：初始溫度40℃，保持3 min；以6℃/min升溫至106℃；以3℃/min升溫至142.6℃，保持1 min；以6℃/min升溫至180℃；以4℃/min升溫至200℃；再以2℃/min升溫至235℃。進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為50∶1；進(jìn)樣量：0.4 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），采用Scan監(jiān)測模式進(jìn)行掃描，離子源溫度：230℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲時間：3.8 min。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)辛揮發(fā)性成分鑒定 按2.2節(jié)分析條件，對細(xì)辛揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，其GC-MS總離子流圖見圖1，以峰面積歸一化法計算細(xì)辛揮發(fā)油各組分的相對含量。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得質(zhì)譜圖，采用化學(xué)工作站對各峰質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST08和NIST08s標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，人工譜圖解析，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對細(xì)辛揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，結(jié)果見表1。

表1 水蒸氣蒸餾法和頂空進(jìn)樣法細(xì)辛揮發(fā)油GC-MS成分分析結(jié)果Tab.1 GC-MS analysis results of Asarum heterotropoides volatile components extracted by steam distillation and headspace injection

圖1 細(xì)辛揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of Asarum heterotropoides volatile components

3.2 不同提取方法所得的細(xì)辛揮發(fā)性化學(xué)成分的定性比較與分析 本實驗采用GC-MS對水蒸氣蒸餾提取法和頂空進(jìn)樣法制備的細(xì)辛揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行比較分析。比較兩種方法提取到的揮發(fā)性成分可知：采用水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中分離鑒定出35種化合物，占揮發(fā)性成分總相對含量的33.75%，其中相對含量大于2%的組分有3種，分別為甲基丁香酚（11.97%）、3-蒈烯（3.64%）、黃樟醚（2.61%）；采用頂空進(jìn)樣GC-MS分析，分離鑒定出66種化合物，占揮發(fā)性成分總含量的87.16%，其中相對含量大于2%的組分有11種，分別為黃樟醚（11.27%）、甲基丁香酚（10.37%）、鄰苯二甲酸二乙酯（8.49%）、正十六烷（7.60%）、3，5-二甲氧基甲苯（7.51%）、2，4，6-三甲氧基甲苯（5.41%）、3，4，5-三甲氧基甲苯（4.19%）、右旋龍腦（3.74%）、β-蒎烯（3.30%）、α-蒎烯（3.18%）、優(yōu)葛縷酮（2.37%）。

比較測得的揮發(fā)性成分種類和相對含量可知水蒸氣蒸餾法檢測到的化合物包含萜烯類、苯丙類、醇類、醚類、酮類、酚類、醛類和其它類化合物，其中相對含量較高的是酚類成分12.16%，萜烯類成分8.36%，苯丙類成分4.92%；頂空進(jìn)樣法檢測到的化合物包含萜烯類、苯丙類、烷烴類、醇類、醚類、酮類、酚類、醛類、酯類、脂肪酸類和其它類化合物，其中相對含量較高的是苯丙類成分18.38%，醚類成分12.86%，萜烯類成分11.71%。

2種方法共鑒定出73種化合物，其中有28種共有化合物（α-蒎烯、茨烯、β-蒎烯、月桂烯、3-蒈烯、（+）-檸檬烯、水芹烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、（S）-順式-馬鞭草烯醇、右旋龍腦、優(yōu)葛縷酮、α-松油醇、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、草蒿腦、2-異丙基-5-甲基茴香醚、（-）-α-蒎烯、馬芐烯酮、3，5-二甲氧基甲苯、黃樟醚、百里醌、甲基丁香酚、3，4，5-三甲氧基甲苯、2，4，6-三甲氧基甲苯、肉豆蔻醚、5，6-二甲氧基-1-茚酮、欖香素），這些共有化合物占水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油總含量的31.46%，占頂空進(jìn)樣法提取的揮發(fā)油總含量的61.55%。

根據(jù)以上的結(jié)果可知，使用2種方法提取的細(xì)辛揮發(fā)油成分的種類和含量差異較大，推測造成這種差異可能與樣品處理方法不同有關(guān)。采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油的過程中提取時間較長，加熱溫度較高，通過冷凝回流收集揮發(fā)性成分時可能損失掉了很多易揮發(fā)及熱不穩(wěn)定的揮發(fā)性成分。而頂空進(jìn)樣GC-MS分析細(xì)辛藥材揮發(fā)油組分，通過將細(xì)辛粉碎后直接裝入頂空樣品瓶中，密封處理，加熱平衡后，揮發(fā)性氣體直接進(jìn)樣分析，加熱時間較短，提取溫度較低，可以降低一些化學(xué)成分在加熱過程中分解與轉(zhuǎn)化的可能性，同時沒有外部環(huán)境對樣品的可能作用，更能直接反映出細(xì)辛中的揮發(fā)性物質(zhì)。

4 討論

文獻(xiàn)中有關(guān)細(xì)辛揮發(fā)性成分研究的提取方法有水蒸氣蒸餾法[10]、超臨界CO2流體提取法[11]、微波輔助提取法[11]、索氏提取法[12]和超聲輔助提取法[13]等。與這些方法相比，頂空進(jìn)樣可在一定時間內(nèi)使揮發(fā)性成分從藥材中揮發(fā)后直接進(jìn)樣，減少了提取揮發(fā)油所需要的萃取等步驟，具有操作簡單、快速、無溶劑殘留且節(jié)省藥材等優(yōu)點，可用于細(xì)辛揮發(fā)性成分的研究。文章通過使用水蒸氣蒸餾和頂空進(jìn)樣兩種方法，對得到的細(xì)辛揮發(fā)性成分與以往的研究結(jié)果[14-18]進(jìn)行比對，鑒定出細(xì)辛中新的揮發(fā)性成分23個，其中頂空進(jìn)樣法鑒定得到15個成分：糠醛、（-）-反式-松香芹烯、α-氧化蒎烯、檸檬醛、（1R）-（+）-諾蒎酮、金絲娘烯酮、桃金娘烯醛、羅漢柏烯、B-柏木烯、（-）-異長葉醇、佛木烯、鄰苯二甲酸二乙酯、松香芹酮、2-蒈烯、醋酸檜酯；水蒸氣蒸餾法鑒定得到5個成分：2-異丙烯基甲苯、葑醇、1，3-二叔丁基苯、2，4-二叔丁基苯酚、1-羥基環(huán)己基苯基甲酮；兩種方法鑒定得到3個共有成分：2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、百里醌、5，6-二甲氧基-1-茚酮。

本研究評價了水蒸氣蒸餾法與頂空進(jìn)樣法對細(xì)辛揮發(fā)油檢測結(jié)果的影響，結(jié)果表明兩種方法提取到的細(xì)辛揮發(fā)性成分差異明顯，因此在采用GCMS對細(xì)辛揮發(fā)性成分進(jìn)行分析時，可采用兩種方法制備揮發(fā)油，將兩種提取方法獲得的GC-MS分析結(jié)果相結(jié)合，能夠獲得更加全面、具體的細(xì)辛揮發(fā)性成分的信息。