梨小食心蟲細胞色素P450 CYP6AE123 基因的克隆及表達分析

韓 慧，王彪龍，李 恩，胡 軍，馬瑞燕，高玲玲，郭艷瓊

（1.山西農業大學植物保護學院，山西太谷030801；2.澳大利亞聯邦科學與工業研究組織農業與食品部，文布利西澳6913）

梨小食心蟲Grapholita molesta（Busck）屬鱗翅目卷蛾科小食心蟲屬，在全世界廣泛分布，主要為害桃、梨等經濟作物，導致果品產量和質量嚴重下降[1-6]。目前，常用的防治手段為化學防治，但長時間的不合理用藥導致梨小食心蟲對某些殺蟲劑敏感度降低[7]。已有不少研究表明，細胞色素P450 在昆蟲對殺蟲劑的代謝中起著非常重要的作用。

細胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）是一類能夠代謝昆蟲內源化合物（如激素等）和外源性化合物（如植物次生物質、殺蟲劑等）的酶系，在昆蟲的解毒、細胞代謝和平衡中起著關鍵作用[8]。CYP 酶的誘導或抑制是昆蟲與藥物相互作用的基礎，它可以使昆蟲產生拒食、趨避、中毒等癥狀。細胞色素P450 具有多個進化支，包括CYP2、CYP3、CYP4 以及線粒體CYP 簇[9]，其中CYP3 簇最大，包含CYP6、CYP9 家族在內的多個家族。CYP6 家族屬于昆蟲特有的家族，不少研究證明，該家族基因參與外源物質的代謝。例如飛蝗CYP6 家族參與了外源殺蟲劑的代謝[10]，其中CYP6HC1與CYP6HCL1在氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝中起關鍵性作用[8]；岡比亞按蚊CYP6M2基因可對多種不同類別的殺蟲劑產生耐藥性[11]。此外，目前常用的殺蟲劑有阿維菌素、吡蟲啉以及高效氯氟氰菊酯等。其中，阿維菌素因其殺蟲效果好、對人畜毒性低等優勢被廣泛應用于梨小食心蟲的防治[12]。

本研究從前期構建的轉錄組數據庫進行BLAST 檢索，獲得一個細胞色素P450 基因序列。通過克隆獲得cDNA 全長序列，提交P450 國際命名委員會命名為CYP6AE123，并對其進行生物信息學分析和基因表達模式分析，以明確其不同發育階段和不同組織部位的表達特性，及其對不同濃度阿維菌素的響應，為進一步研究其功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用梨小食心蟲采自山西省晉中市太谷區西山底桃園，飼養于山西農業大學生物安全與生物防治研究基地人工培養箱中（MGC-450HP），經室內人工飼養50 代以上，光周期15 L∶9 D，相對濕度70%～80%；幼蟲飼喂人工飼料，成蟲飼喂10%蜂蜜水[13]，期間未接觸任何殺蟲劑。

收集梨小食心蟲不同發育階段樣品，成蟲3 頭、蛹5 頭、五齡幼蟲5 頭、四齡幼蟲5 頭、三齡幼蟲10 頭、二齡幼蟲30 頭、一齡幼蟲50 頭以及卵100 粒[14]。不同組織選取羽化30 h 之內的健康梨小食心蟲成蟲，分別取頭、前腸、中腸、后腸、脂肪體、馬氏管、精巢、卵巢[15]，每個重復取60 頭成蟲。采用阿維菌素LC1（019.82 μg/mL）、LC3（072.90 μg/mL）、LC5（0179.66 μg/mL）分別處理健康的梨小食心蟲成蟲，24 h 后收集存活的成蟲樣品。以上材料均放置于液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱中備用，以上樣品均設置3 次生物學重復。

1.2 梨小食心蟲CYP6AE123 克隆

以云杉卷葉蛾CYP6AE83基因為參考序列，對梨小食心蟲轉錄組數據檢索、BLAST 比對，獲得P450 基因的全長cDNA 序列。利用Primer Preimer 5.0 設計特異性引物（表1）。

根據RNAisoTMPlus 試劑盒說明書提取成蟲總RNA，并取1 μg 反轉錄成cDNA，作為PCR 擴增的模板。PCR 反應體系（50 μL）：5×TransStartRFast Pfu Buffer 10 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、上下游引物各1 μL、cDNA（1×）2 μL、TransStartRFast Pfu DNA polymerase 1 μL、ddH2O 31 μL。反應程序：95 ℃2 min；95 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃1 min，40 個循環；72 ℃5 min。反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外光下切下目的條帶回收純化。將目的基因連接至pEASY-Blunt 載體中，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞。將其涂布于LB 固體培養基中，挑取單克隆驗證，并進行LB 液體培養基過夜培養。菌液驗證后送上海生工生物有限公司測序，提交P450 命名委員會進行命名。

表1 引物

1.3 梨小食心蟲CYP6AE123 生物信息學分析

P450基因的開放閱讀框（openreadingframe，ORF）及氨基酸序列使用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）預測；采用ExPASy 的在線工具Prot-Param （http://web.expasy.org/protparam/）預測CYP6AE123 蛋白的理化性質；采用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.-dk/services/SignalP/）分析信號肽；用NPS@_HNNsecondary[15]（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_consensus.pl）預測蛋白質的二級結構；采用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）進行蛋白質的三級結構同源建模。

根據NCBI BLASTX（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的比對結果找出同源性較高的其他物種的氨基酸序列，在DNAMAN 進行序列比對；采用MEGA 7.0 軟件并運用鄰接法（Neighbor Joining，NJ）構建進化樹，抽樣次數（Bootstrap）設置1 000 次。

1.4 梨小食心蟲CYP6AE123 表達水平分析

提取不同發育階段、不同組織及不同濃度阿維菌素處理后的梨小食心蟲總RNA，并取1 μg 為模板反轉錄為cDNA。以β-actin為內參基因，RT-qPCR檢測CYP6AE123基因的相對表達量。每組樣品均設置3 次技術重復。反應體系（20 μL）：SYBR qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L 的上下游引物（表1）各0.4 μL、稀釋10 倍的cDNA 模板1 μL、去離子水8.2 μL。擴增條件為：94 ℃30 s；94 ℃10 s，50 ℃30 s，72 ℃，30 s，于72 ℃收集熒光，共40 個循環。采用2-ΔΔCT 法[16]計算相對表達量。

1.5 數據分析

使用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析（one way-ANOVA），采用Tukey 法進行差異顯著性分析，采用Excel 2016 進行數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 梨小食心蟲CYP6AE123 的克隆及序列分析

通過檢索、比對、克隆和測序，獲得梨小食心蟲細胞色素P450CYP6AE123的cDNA 全長序列（圖1），提交P450 命名委員會，命名為CYP6AE123。ORF 長度為1 524 bp，編碼507 個氨基酸；蛋白分子質量為58 176.72 u，理論等電點為7.07，不穩定指數為37.50，故該基因編碼的蛋白是穩定的；脂肪系數為89.41，總平均親水性為-0.110，屬疏水性蛋白。二級結構表明，CYP6AE123編碼的蛋白主要由α 螺旋（46.55 %），無規則卷曲（42.80%）以及延伸鏈（8.48 %）組成，三級結構同源建模模擬了P450CYP6AE123的特征序列和空間結構（圖2）。

2.2 梨小食心蟲CYP6AE123 基因的系統發育分析

BLAST 比對結果表明，梨小食心蟲與鱗翅目昆蟲蘋果蠹蛾Cydia pomonella（Cp）、小線角木蠹蛾Streltzoviella insularis（Si）、棉鈴蟲Helicoverpa armigera（Ha） 的氨基酸序列一致性分別高達83.67%、57.39%、52.61%（表2）。

表2 梨小食心蟲CYP6AE123 的BLAST 比對

多序列比對如圖3 所示，梨小食心蟲CYP6AE123具有細胞色素P450 的特征區域，包括螺旋I、螺旋C、螺旋K、Meander 區以及血紅素結合區。

系統發育分析結果顯示（圖4），進化樹中多為各物種的CYP6AE 家族，表明克隆得到的基因屬于CYP6AE 亞家族；且梨小食心蟲CYP6AE123與煙草天蛾CYP6AE129聚在一起，表明二者親緣關系最近，可能具有相似功能。

不同發育階段表達模式如圖5 所示，CYP6AE123在梨小食心蟲所有發育階段均有表達，成蟲期和五齡幼蟲相對較高，且差異達顯著水平（P＜0.05）；其他齡期表達相對較低，且各階段之間無明顯差異。其中，卵期表達量最低，成蟲期表達量是卵期的49.20 倍，五齡幼蟲時期表達量是卵期的26.92 倍。

不同組織表達結果表明，CYP6AE123在成蟲的脂肪體中表達量最高，中腸次之；前腸和精巢中表達量最低；脂肪體中CYP6AE123表達量為精巢中的8.81 倍、前腸的6.35 倍；中腸表達量是精巢的5.42 倍、前腸的3.90 倍（圖6）。

采用不同濃度的阿維菌素對梨小食心蟲成蟲進行處理，結果表明，低濃度阿維菌素（LC10、LC30）處理后，CYP6AE123表達量較CK 降低，但二者間無顯著變化；當濃度增加到LC50（179.66 μg/mL）時，CYP6AE123表達顯著增加，為CK 的5.80 倍，且二者間差異達顯著水平（P＜0.05）（圖7）。

3 結論與討論

本研究對梨小食心蟲CYP6AE123的多序列比對結果表明，該基因的氨基酸序列與蘋果蠹蛾、小線角木蠹蛾、棉鈴蟲的氨基酸序列一致性分別高達83.67%、57.39%、52.61%，且均有細胞色素P450 的保守區域，這些保守區域常被用作鑒定P450 的主要特征[17]。

本研究為了進一步研究CYP6AE123的分子特性和生物功能，對不同發育階段與不同組織中CYP6AE123的表達水平進行了表達模式研究，結果顯示，梨小食心蟲CYP6AE123在成蟲期和五齡幼蟲期表達量較高，因為成蟲期是梨小食心蟲為數不多暴露于環境中的時期，也是農民防治的關鍵期[18]，在這個發育階段CYP6AE123基因表達量上調，相似的結果在斜紋夜蛾中也有體現[19]。不同組織中基因表達量顯示，CYP6AE123基因在脂肪體中表達量最高，中腸次之，可能是因為脂肪體主要用于儲存能量以及對外源有毒物質的代謝[20]，而中腸是昆蟲的消化器官，暗示該基因可能與梨小食心蟲外源物質代謝有關。研究發現，殺蟲劑對昆蟲的誘導表達與基因代謝外源物質密切相關。例如，在氯蟲苯甲酰胺處理甜菜夜蛾后，CYP9 家族基因被誘導，進一步驗證Unigene0035508 基因參與代謝氯蟲苯甲酰胺[21]；蘋果黃蚜細胞色素P450 基因AcCYP6CY14表達可增強吡蟲啉抗性[22]。本研究發現，高濃度阿維菌素（179.66 μg/mL）誘導梨小食心蟲CYP6AE123表達，但該基因是否參與梨小食心蟲對阿維菌素的代謝尚不明確，下一步將對其進行RNAi，進一步明確其功能。

本研究克隆了梨小食心蟲CYP6 家族基因CYP6AE123，該基因屬于CYP6AE 亞家族，且包含細胞色素P450 的識別特征；表達分析研究表明，CYP6AE123在成蟲期和脂肪體高表達，且被高濃度的阿維菌素誘導表達，推測其可能參與梨小食心蟲對阿維菌素的代謝，研究結果可為進一步探究梨小食心蟲CYP6AE123基因的功能奠定基礎。