白芍總苷對(duì)木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的膝骨性關(guān)節(jié)炎模型Rho/Rock信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用

王 健

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，沈陽(yáng) 110032）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的非炎性退行性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退化或丟失、軟骨下骨硬化、關(guān)節(jié)邊緣骨質(zhì)增生形成骨贅等為主要的病理特征[1]，以膝關(guān)節(jié)最為常見，約占所有骨性關(guān)節(jié)炎的80%以上[2]。資料顯示，該病在全世界的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為3.8%，我國(guó)發(fā)病率為3%～15.6%，65 歲以上人群更是高達(dá)68%[3-4]。研究認(rèn)為，白芍總苷在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中有較好療效[5]，但干預(yù)骨性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)研究較少。我們從對(duì)Rho/Rock 信號(hào)通路的影響出發(fā)，探討白芍總苷對(duì)去骨性關(guān)節(jié)炎癥的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

8 周齡清潔健康雄性SD 大鼠90 只，平均體質(zhì)量（245.26±8.93）g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（21±2）℃，濕度（50±5）%，自由進(jìn)食普通標(biāo)準(zhǔn)飼料和蒸餾水，定期清掃、更換墊料及消毒。白芍總苷膠囊，批號(hào)：20180103，購(gòu)自寧波立華制藥有限公司，采用無菌生理鹽水溶解配制成濃度為5、10、20 mg/mL 的白芍總苷溶液；雙醋瑞因膠囊，批號(hào)：20180215，購(gòu)自昆明積大制藥有限公司；木瓜蛋白酶，CAS 號(hào)：9001-73-4，貨號(hào)：BM0969，購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。大鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒，購(gòu)自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；鼠抗Ras 同源基因A（Rho A）、Rho 相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶1（ROCK1）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體，購(gòu)自廈門慧嘉生物科技有限公司。C3000 型離心機(jī)，北京托摩根生物科技有限公司產(chǎn)品；FC 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀、E-Gel Imager 型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；IX73 型熒光顯微鏡，日本Olympus 公司；DYCZ-20H型電泳儀，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及給藥方法[6]大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組15 只及造模組75 只，禁食12 h 麻醉，于右后肢膝關(guān)節(jié)周圍1 cm 區(qū)域常規(guī)備皮、消毒，自右后肢膝關(guān)節(jié)髕腱外緣進(jìn)針，至股骨髁后退回2 mm，造模組向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射恢復(fù)至室溫的4%木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，對(duì)照組向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射無菌生理鹽水0.2 mL，注射時(shí)間為第1 天、第4 天、第7 天。2 周后成功建立骨性關(guān)節(jié)炎模型。造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、白芍總苷低、中、高濃度組及雙醋瑞因組，各15 只，模型組及對(duì)照組分別灌胃給予無菌生理鹽水5 mL/kg，每日1 次；白芍總苷低、中、高濃度組分別灌胃給予5、10、20 mg/mL 白芍總苷溶液5 mL/kg，每日1次；雙醋瑞因組灌胃給予2 mg/mL 雙醋瑞因溶液5 mL/kg，每日1 次。各組大鼠均連續(xù)給藥8 周。

2.2 標(biāo)本采集與處理 腹腔注射10%水合氯醛溶液5 mL/g 麻醉大鼠，屈伸活動(dòng)大鼠左后肢膝關(guān)節(jié)，向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水2 mL 并反復(fù)抽吸，離心，取上清液置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存；處死大鼠，采用組織刀片刮取脛骨平臺(tái)及股骨髁軟骨，將脛骨平臺(tái)軟骨置于10%中性甲醛溶液內(nèi)固定48 h，后常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片機(jī)制備厚度為6 μm 的組織切片，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

2.3 TUNEL 法測(cè)定大鼠軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)[7]取軟骨組織切片參考TUNEL 試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)定大鼠軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)。

2.4 ELISA 法檢測(cè)關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α 水平 取關(guān)節(jié)液上清液，恢復(fù)至室溫，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀，嚴(yán)格按照ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書操作，檢測(cè)關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α 水平。

2.5 Western-blot 法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織RhoA、Rock1、Bcl-2 表達(dá)水平[7]凍存的股骨組織置于液氮內(nèi)研磨成粉，參考Western-blot 試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織RhoA、Rock1、Bcl-2 表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件包分析，符合正態(tài)性的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)肉眼觀察結(jié)果 對(duì)照組關(guān)節(jié)液透明清亮，無炎癥反應(yīng)，滑膜形態(tài)正常，軟骨呈明亮的淡藍(lán)色，表明光滑，未見裂紋、軟化灶；模型組關(guān)節(jié)液為黏稠的黃色濾泡樣，關(guān)節(jié)顏色淡黃無光澤，滑膜肥厚且表面凹凸不平，軟骨彈性及厚度下降，部分可見裂紋及破潰；白芍總苷低、中濃度組關(guān)節(jié)液顏色淡黃存在少量濾泡，滑膜肥厚較模型組不同程度減輕，關(guān)節(jié)稍呈白色，軟骨透明度一般但較模型組不同程度好轉(zhuǎn)；骨碎補(bǔ)組、白芍總苷高濃度組及雙醋瑞因組關(guān)節(jié)液接近透明，滑膜未見明顯肥厚，關(guān)節(jié)稍呈白色，光澤度一般，軟骨透明度較高，表面無裂紋、破潰。

4.2 各組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）比較 TUNEL

染色結(jié)果顯示，與模型組比較，白芍總苷低、中、高濃度組及雙醋瑞因組大鼠軟骨AI 均較低，且白芍總苷低濃度組＞白芍總苷中濃度組＞白芍總苷高濃度組和雙醋瑞因組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠軟骨AI 比較（，n =15）

表1 各組大鼠軟骨AI 比較（，n =15）

注：與模型組比較，# P ＜0.05；與白芍總苷低濃度組比較，△P＜0.05；與白芍總苷中濃度組比較，▲P ＜0.05

4.3 各組大鼠關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α 水平比較 與模型組比較，白芍總苷低、中、高濃度組及雙醋瑞因組大鼠關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α 水平均較低，且白芍總苷低濃度組＞白芍總苷中濃度組＞白芍總苷高濃度組和雙醋瑞因組（P＜0.05）。（見表2）。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α 水平比較（，n =15）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α 水平比較（，n =15）

注：與模型組比較，# P ＜0.05；與白芍總苷低濃度組比較，△P ＜0.05；與白芍總苷中濃度組比較，▲P ＜0.05

4.4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織RhoA、Rock1、Bcl-2、Bax 表達(dá)水平比較 與模型組比較，白芍總苷低、中、高濃度組及雙醋瑞因組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織RhoA、Rock1 表達(dá)水平較低，且白芍總苷低濃度組＞白芍總苷中濃度組＞白芍總苷高濃度組和雙醋瑞因組（P＜0.05）。與模型組比較，白芍總苷低、中、高濃度組及雙醋瑞因組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織Bcl-2 表達(dá)水平均較高，且白芍總苷低濃度組＜白芍總苷中濃度組＜白芍總苷高濃度組和雙醋瑞因組（P＜0.05）（見表3）。

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織RhoA、Rock1、Bcl-2 表達(dá)水平比較（，n =13）

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織RhoA、Rock1、Bcl-2 表達(dá)水平比較（，n =13）

注：與模型組比較，# P ＜0.05；與白芍總苷低濃度組比較，△P ＜0.05；與白芍總苷中濃度組比較，▲P ＜0.05

5 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎為老年常見的關(guān)節(jié)骨病，具有經(jīng)久難愈、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，為臨床治療難題之一[8-10]，其發(fā)生受到年齡、肥胖、機(jī)械等因素的影響，發(fā)病機(jī)制涉及到金屬蛋白酶及其抑制劑表達(dá)、炎性細(xì)胞因子釋放、軟骨代謝相關(guān)信號(hào)通路等多方面變化，尚未完全明確。中醫(yī)認(rèn)為，膝骨性關(guān)節(jié)炎屬于“骨痹”“膝痹”“歷節(jié)病”等范疇[11]，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛是肝腎虧虛、氣血不足致經(jīng)脈失濡，標(biāo)實(shí)為寒濕侵襲、氣滯血瘀致經(jīng)氣不通。中醫(yī)藥在此方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，日益受到醫(yī)學(xué)界關(guān)注。在本次研究中，我們即采用中藥提取物白芍對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠進(jìn)行干預(yù)，以觀察其治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的可能性。

我們采用不同濃度的白芍總苷對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥大鼠模型進(jìn)行治療，白芍總苷具有抗炎癥反應(yīng)、清除氧自由基、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗凝、抗心肌重構(gòu)、等藥理作用，在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚及骨骼系統(tǒng)等多種疾病中均有較好的干預(yù)效果[12-13]。王歡等[14]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白芍總苷能通過調(diào)節(jié)人膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖來影響骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程；我們采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射法誘導(dǎo)膝骨性關(guān)節(jié)炎，軟骨的退行性改變和破壞是膝骨性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)病理變化，軟骨細(xì)胞凋亡增加，打破了軟骨正常代謝平衡，可引起軟骨退變消失，若伴有細(xì)胞外基質(zhì)降解，則最終引發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎[15]。軟骨細(xì)胞凋亡率與骨性關(guān)節(jié)炎軟骨損傷程度密切相關(guān)。TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示高濃度白芍總苷可以有效抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。

研究表明，膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與炎性反應(yīng)有關(guān)，發(fā)病過程中有IL-1β、TNF-α 等多種炎性因子參與其發(fā)病過程[16]，這些炎性因子由單核細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等釋放，不僅可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引發(fā)局部癥狀，還能通過激活Rho/Rock 等相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，加速軟骨退化和病情進(jìn)展。RhoA 和Rock1 是Rho/Rock 信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子，RhoA 屬于鳥苷三磷酸（GTP）酶家族一員，在信號(hào)通路中扮演分子開關(guān)的角色，能夠被IL-1β、TNF-α 等炎性因子激活，進(jìn)而激活下游靶分子Rho 激酶，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)；Rock1 為Rho 激酶的一種，被激活后可參與軟骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞骨架重建、基因表達(dá)等過程的調(diào)節(jié)。Rho/Rock 信號(hào)通路表達(dá)強(qiáng)化可能加速軟骨損傷及退行性病變進(jìn)展，誘發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎。Bcl-2 是Rho/Rock 信號(hào)通路下游的信號(hào)分子，具有抗細(xì)胞凋亡的作用，當(dāng)Rho/Rock 信號(hào)通路活性被抑制時(shí)，Bcl-2 表達(dá)水平上調(diào)，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。