叢枝菌根真菌對金葉六道木鎘吸收及根際真菌群落結構的影響*

劉 琛，郭 彬，林義成，傅慶林，李凝玉

（浙江省農業科學院環境資源與土壤肥料研究所，杭州 310021）

2014 年《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，我國土壤Cd 污染物點位超標率達到7.0 %，是主要污染物之一，嚴重影響作物的產量和品質，危害人體健康[1-2]。有關Cd 污染土壤的治理方法有很多，其中植物修復具有土壤擾動小、原位性、不產生二次污染等優點，是一種優先考慮的環境友好型修復技術[3]。

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizae，AM）真菌是土壤生態系統中一種同時具有植物根系和微生物特性的互惠共生體[4-5]。近年來，植物-菌根真菌聯合修復已成為當前植物修復研究的熱點。一方面菌根真菌對植物修復有直接強化作用，可以促進植物地上部分對重金屬轉運富集作用以及增強植物根系固持作用[6]。Liu 等[7]研究結果表明，在50 mg·kg–1Cd濃度條件下，接種Glomus versiforme 后，龍葵根、莖Cd 含量可分別增加61%和74%。另一方面可提升植物對重金屬脅迫的抗性以及促進相應的解毒及耐受過程，提高植物在重金屬污染環境的生存能力及活性，進而對植物修復產生間接強化效應[8]。Chen等[9]研究發現，接種AM 真菌后可以激發HMA3 的表達，將更多的Cd 固定在液泡中，從而減少Cd 從根系向地上部轉移。Li 等[10]發現AM 真菌通過改變水稻Cd 化學形態和亞細胞分布，使水稻地上部和根系的Cd 濃度顯著降低，從而增強水稻抗Cd 的能力。此外，AM 真菌產生的球囊蛋白也可以固定土壤中的Cd，減少有效Cd 含量[11]。AM 真菌的作用效果取決于AM 真菌種類、植物種類、重金屬的濃度及土壤的基本性質[12-13]。當前關于植物-菌根共生體的研究主要集中于草本植物，如龍葵、東南景天等，而對木本植物的互作研究相對較少。

和超積累植物等草本植物相比，木本植物具有生物量大、根系發達的特點，對重金屬具有較強的耐性和富集能力，例如圣櫟、杞柳、藍冰柏等[14-16]。研究表明，金絲垂柳 1011 對 Cd 的富集可達到231.4 μg·kg–1[17]。綠化苗木修復的關鍵在于其吸收和轉移的Cd 總量，利用AM 真菌促進綠化苗木的吸收，通過綠化苗木吸收再移栽綠化的方式修復重金屬污染土壤，不僅可解決修復植物殘體后續處置的難題，同時還能在污染土壤上產出客觀的經濟效益，對推動土壤污染修復產業化具有重要意義[18]。

AM 真菌自身就是土壤微生物結構中重要的一部分，其結構及組成也會受到環境因子、土壤因子和生物因子的影響[19]。Cd 脅迫會影響AM 真菌的菌絲長度、代謝活性和功能[20-21]。接種AM 真菌也會影響植物的根際分泌，從而改變土壤微生物種群結構[22]。土壤中微生物種群通過吸收、固定、吸等方式對土壤中Cd 的行為起至關重要的作用[23]。因此，有必要明確接種叢枝菌根真菌后對綠化苗木根際土壤微生物群落結構的影響。

基于此，本文擬研究接種AM 真菌對不同綠化苗木吸收Cd 的影響，篩選出最佳組合，并探索接種AM 真菌后對綠化苗木根際土壤AM 真菌群落結構的影響，明確AM 真菌促進綠化苗木Cd 吸收的機理，以期為利用綠化苗木-AM 真菌聯合技術修復Cd 污染土壤提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

收集礦區植物根際土壤混合樣品，經風干后放入塑料袋內。AM 真菌孢子收集用濕篩法。

AM 真菌制備所用土壤是砂土，使用前121℃滅菌2 h，48h 后再重復一次，以滅絕土壤中所有真菌。將濕篩法得到的孢子，先移入蒸餾水反復清洗，然后再加入到滅菌土，充分混勻后裝盆。宿主植物使用的是高梁種子。經過3 個月的生長，培養基質自然風干后磨碎過篩，此基質中所含的細根根段、菌絲和孢子作為土著AM 真菌菌種。自制備的土著AM 真菌標記為AMF1，由北京市農林科學院植物營養與資源研究所提供的摩西球囊霉真菌標記為AMF2（HK01，1511c001BGCAM0064）。

試驗用綠化苗木包括：金禾女貞（Ligustrum quihoui）、金葉六道木（Abelia grandiflora ‘Francis Mason’）、茶梅（Camellia sasanqua Thunb.）、金森女貞（Ligustrum japonicum ‘Howardii’）、小葉蚊母（Distylium buxifolium）、紅葉石楠（Photinia × fraseri Dress）、花葉女貞（Ligustrum sinense ‘Variegatum’）、紅王子錦帶（Weigela florida cv. Red Prince）、濱柃（ Eurya emarginata（ Thunb.） Makino）、 桂 花（Osmanthus fragrans（Thunb.）Lour）、金邊胡頹子（Elaeagnus pungens var. varlegata Rehd.）和花葉錦帶（Weigela florida cv. Variegata.），共12 種。

1.2 試驗設計

試驗共設置四個處理，分別為：CK，不加Cd；AM0，加Cd 和滅活AMF 菌劑對照；AM1，加Cd 和AMF1；AM2，加Cd 和AMF2。基質由浙江德清加州農業股份有限公司提供，按前述方法滅菌后按5%的接種量（w∶w）接種滅菌或未滅菌AM 菌劑。移入綠化苗木，穩定1 個月后，將 228 g CdCl2·2.5 H2O溶解于3 L 蒸餾水中，利用注射器均勻打入加Cd處理基質對照和加Cd 處理的基質淋溶液Cd 濃度分別為3 和10 mg·kg–1。

試驗在浙江德清加州農業股份有限公司開展，培養期為2017 年1 月至12 月，共計12 個月。

培養6 個月時采集所有綠化苗木的葉片，烘干后測定其Cd 含量。12 個月后采集金葉六道木的根、葉片及枝條，烘干后測定其Cd 含量[24]。收集金葉六道木的根際基質進行后續分析。

1.3 土壤微生物磷酸脂肪酸組成的分析

采用修正的Bligh-Dyer 方法，以甲酯19:0 做內標，用 Aligent 6890 氣相色譜儀測定，用 MIDI Sherlock 微生物鑒定系統[25]。其中脂肪酸15:0，17:0，i15:0，i16:0，i17:0，a15:0，a17:0，16:1ω7c，18:1ω7c，cy17:0 和cy19:0 用于指示細菌PLFAs，18:2ω6，9c 用于指示真菌PLFAs[26]，16:1ω5c 用于指示AM真菌PLFAs[27]。

1.4 PCR 與測序

對每份土壤樣品，菌根真菌采用一對特異性的引物擴增，引物序列為：AMV4.5NF（5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′）和AMDGR（5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′）[28]。體系為25 μL，包括12.5 μL Buffer（2×）、2 μL dNTP、5 μL DNA 模板（20 ng）、正反引物各1 μL（10 μmol·L–1）和3.5 μL的滅菌雙蒸水。陰性對照用滅菌雙蒸水代替DNA作為反應模板。反應程序為：95℃ 10 min；95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 30s，40 循環。上述PCR 產物純化后由天昊生物科技股份有限公司利用Illumina HiSeq 測序平臺完成測序。

1.5 數據分析

生物轉移系數（translocation factor，TF）=C地上部/C根。式中，C地上部表示地上部分的重金屬含量，C根表示地下部分的重金屬含量。

對于下機的測序數據，進行拼接、質控和嵌合體過濾，得到可用于后續分析的有效數據。使用UPARSE 去除singleton 序列，同時使用denovo 模式去除嵌合體序列，最終產生用于物種分類的操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）。使用qiime 軟件，找出與OTU 序列相似度最高且可信度達80%以上的物種信息用于OTU 的注釋。應用軟件mothur（http：//www.mothur.org/）計算香農指數、Chao 1 指數和覆蓋率指數（good’s coverage）。根據 OUT 分布情況，進行聚類分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）。

所有結果用平均數±標準偏差表示。利用SPSS 22.0 統計軟件對結果進行單因素方差分析，并利用Tukey 法檢驗同一因素下各處理間差異的顯著性。

2 結 果

2.1 不同苗木對Cd 的吸收

如圖1 所示，加Cd 后，12 種綠化苗木葉片濃度變化范圍為0.25～2.59 mg·kg–1。與對照相比，加Cd 對金森女貞和濱柃影響不顯著。其余十種綠化苗木葉片Cd 含量由小到大順序為：茶梅、桂花、金禾女貞、花葉女貞、金邊胡頹子、小葉蚊母、紅王子錦帶、紅葉石楠、金葉六道木、花葉錦帶。花葉錦帶葉片Cd 濃度最高，為2.59 mg·kg–1，其次為金葉六道木，葉片Cd 濃度為2.16 mg·kg–1。除桂花和濱柃外，接種AM 真菌處理組的葉片Cd 含量均高于不接菌處理組，接種AM 真菌后顯著增加了植物葉片Cd 含量。相比未接種對照，接種AM2 后金葉六道木葉片中Cd 含量增加了147.9%。表明金葉六道木對土壤重金屬Cd 具有較好吸收和富積能力，可以作為土壤Cd 污染修復的優良綠化苗木。

圖 1 不同綠化苗木葉片Cd 濃度（6 個月）Fig. 1 Cd concentration in leaves of green seedlings（6 months）relative to species

表1 培養12 個月金葉六道木不同部位Cd 濃度與含量Table1 Cd concentration and contents in different parts of A. grandiflora（12 months）

由表1 可知，種植12 個月后，AM0 處理金葉六道木根、枝、葉片Cd 濃度分別為62.27、11.10和6.01 mg·kg–1。葉片Cd 濃度增加為6 個月前的2.78倍。添加AM2 菌劑后，金葉六道木對Cd 的吸收顯著增加，根、莖、葉Cd 濃度分別為164.7、22.86和10.57 mg·kg–1，為AM0 處理的2.64 倍、2.06 倍和1.76 倍，說明添加叢枝菌根真菌后可以增加金葉六道木對Cd 的吸收。Cd 脅迫條件下，金葉六道木地上部和全株Cd 含量分別為1 459 和1 745 μg·株–1，轉移系數為0.21。接種AM2 后，金葉六道木體內Cd 含量為5 078 μg·株–1，其轉移系數為 0.10，說明接種AM 真菌后可以降低轉移系數，并將其更多吸收的Cd 固定在根內。

2.2 接種AM 真菌對金葉六道木根際土壤微生物生物量的影響

Cd 脅迫條件下，土壤中總PLFA 生物量、細菌PLFA 生物量、真菌PLFA 生物量分別為101.7、32.91和5.60 nmol·g–1（見表2），顯著高于對照。這說明Cd 在一定的濃度范圍內可刺激根際土壤微生物數量增加。與不接菌相比，接種AM 真菌降低了六道木根際土壤微生物總PLFA 生物量、細菌PLFA 生物量及真菌PLFA 生物量，但增加了AM 真菌PLFA 生物量。AM1 和AM2 處理間總PLFA 生物量、細菌PLFA 生物量和AM 真菌PLFA 生物量差異不顯著。

表2 金葉六道木根際土壤微生物PLFA 量Table2 PLFA biomass of microorganisms in the rhizosphere soil of A. grandiflora

2.3 根際土壤微生物群落結構

表3 為高通量測序優質序列的分布結果，各樣品測序量在97 411 條至119 212 條之間，優質序列占有效序列的 98 %以上。序列長度集中分布在212～218 bp 之間，平均長度222 bp。四個處理用于物種分類的OTUs，分別為365、357、347、311，其中CK 處理的OTU 數最高，但與其他處理間差異不顯著。在對照樣品中香農指數最低，為2.79；Cd脅迫下后增加了金葉葉六道木根際AM 真菌香農指數，接種AM1 和AM2 后香農指數分別為2.92 和3.21。Cd 脅迫對根際AM 真菌Chao1 指數的影響不顯著，接種AM1 和AM2 后豐富度下降，特別是接種AM2，下降幅度達21%。不同樣品間的覆蓋率指數差異不顯著。

表3 AM 真菌的豐度、多樣性指數及豐富度指數Table3 Abundances，Diversity and Richness indexes of AMF

圖2 群落結構組成Fig. 2 AMF community structure

圖3 主成分分析圖Fig. 3 Principal component analysis

從群落結構組成圖（圖2）可以看出，所有樣本中的AM 真菌主要分屬于三個科，分別是球囊霉科（Glomus）、類球囊霉科（Paraglomus）和原囊霉科（Archaeospora）。其中球囊霉科占總AM 真菌的55%以上，占絕對優勢。在不同處理間，球囊霉科和類球囊霉科的相對豐度具有顯著變化。Cd 脅迫條件降低了類球囊霉的豐度，增加了原囊霉科的豐度。相比未接菌，接種AM2 后球囊霉科豐度顯著增加，由63.7%上升至77.4%。接種AM1 后類球囊霉科豐度顯著增加，由對照的13.1%上升至17.8%。主成分分析結果顯示（圖3），Cd 脅迫會顯著影響植物根際真菌群落結構。2 個主成分的貢獻率分別為34.06 %和16.42 %，累計貢獻率為50.48 %。主成分1 可以區分加Cd 處理組和對照組，主成分2 可以區分接種AM2 和不接菌處理。因此，Cd 和AM 真菌接種可以改變金葉六道木根際AM 真菌群落結構。

3 討 論

Cd 脅迫條件下，花葉錦帶和金葉六道木葉片Cd 濃度分別為2.59 和2.16 mg·kg–1。考慮到花葉錦帶屬于落葉灌木，故選擇屬于常綠灌木的金葉六道木作為后期研究的對象。本試驗中由于采用基質培養，基質具有強大的緩沖性，添加Cd溶液150 mg·kg–1后，其基質淋溶液Cd 濃度為10 mg·kg–1，相當于一般試驗中土壤中Cd 添加量為50 mg·kg–1。目前，國內外發現的Cd 超積累植物有17 種，主要為草本植物，而超積累植物生長緩慢、生物量低[29]。比如，當Cd 濃度為50 mg·kg–1時，雜草龍葵的莖、葉中Cd 濃度分別為121.16、118.23 mg·kg–1，但每株龍葵的Cd 含量僅為14.61 μg[7]；東南景天的的莖、葉中Cd 濃度分別高達1 750、500 mg·kg–1，總Cd 含量小于1 000 μg·盆–1[30]。本試驗中，種植12 個月后，金葉六道木的根、莖、葉Cd 濃度分別為62.27、11.10和6.01 mg·kg–1，植株體內總Cd 含量達1 745 μg·株–1，遠高于龍葵和東南景天，表現出了良好的Cd 修復能力。相比于其他修復植物后期處理的風險，綠化苗木可以通過移栽，將固定的Cd 進行轉移并實現綠化功能。移栽3 個月后苗木所吸收的Cd 仍主要固定于體內，移栽后Cd 釋放的風險較小，是一種環境友好的修復技術[16]。當然，被移栽的地點需要慎重選擇，以避免帶來新的風險[31]。研究結果顯示，金葉六道木根系吸收的 Cd 含量占總植物體的78%～93%，而植物根系卻難以從土壤中收集。今后可以研發合適的技術將植株體連同根系一起收獲，以保證植物提取修復效率，同時可預防二次污染的發生。

提高植物的修效率，探討植物修復的強化措施對于植物修復的應用仍顯得尤為重要。接種AM 真菌后，金禾女貞、小葉蚊母、金葉六道木等10 種苗木葉片Cd 含量均顯著增加，其中增幅最大的為金葉六道木，為未接種的2.47 倍。12 個月后，接種AM2 處理金葉六道根、莖、葉Cd 濃度分別為不接菌處理的2.64 倍、2.06 倍和1.76 倍。上述結果表明，AM 真菌可促進植物對 Cd 的吸收。其他學者也發現了類似的結果。Liu 等[7]研究發現，接種AM 真菌后龍葵枝和根的吸收量分別為131.79 和51.42 μg·盆–1，遠高于未接菌的51.30 和21.76 μg·盆–1。陳良華等[32]研究結果表明接種AM 真菌引起美洲黑楊雄株葉片、莖、粗根、細根Cd 積累量及總積累量分別增加85%、53%、81%、236%和160%，顯著提高美洲黑楊Cd 積累能力。在本研究中，Cd 在金葉六道木地上部枝葉內濃度較低，根系內濃度相對較高，接種AM2 后降低了轉移系數，降低了Cd 轉運至地上部的比例，增加了根系對Cd 的富集能力，從而減少了Cd 對莖葉的毒害作用，增強了植物根系Cd 的固持作用，進一步強化了金葉六道木對Cd 修復的效率。寧楚涵等[33]研究結果也表明，相比對照，接種摩西斗管囊霉抑制了蘆葦和狼尾草根系Cd 向地上部的轉移作用，增加了根系對Cd 的富集能力，減少了Cd 對植物莖葉的毒害作用。

在本研究中，不同苗木品種對AM 真菌也表現出不同的偏好性。對于金葉六道木而言接種AM2的強化效果優于接種AM1；而紅葉石楠和小葉蚊母則相反。陳雪等[34]研究發現，相比異形根孢囊霉，接種摩西管柄囊霉對龍葵 Cd 富集系數的效應最大。楊秀敏等[35]的研究表明，相比摩西管柄囊霉，接種根內球囊霉對東南景天Cd 提取量增加效果更優。因此，有必要針對不同的修復植物，篩選與培育最佳的植物-AM 真菌聯合修復的組合。

研究發現利用外源加入有益微生物，對 Cd 脅迫下土壤根際環境有一定的改善作用。杜俊卿[36]發現接種叢植菌根能增加大葉女貞、法國冬青等綠化植株土壤中細菌、真菌、放線菌的數量。但在本研究中，接種AM 真菌后細菌PLFA 生物量、真菌PLFA生物量、微生物總PLFA 生物量反而下降。這可能是由于苗木種植所采用的基質均預先滅菌過，所接菌種與新生微生物產生了競爭關系。結果顯示，相比不接菌處理，接種AM2 后，AM 真菌PLFA 生物量顯著增加，但AM 真菌的群落多樣性、豐富度卻下降，意味土壤AM 真菌群落中優勢種的相對比例增加， 群落向著更加集中的方向發展。Martínez-García 等[37]觀察到在宿主植物根際中的AM 真菌群落多樣性遠低于土壤中的AM 真菌群落多樣。

群落結構分析結果表明，金葉六道木根際的主要AM 真菌分別為球囊霉科（Glomeraceae）、類球囊 霉 科（ Paraglomeraceae ） 和 原 囊 霉 科（Archaeosporaceae），其中球囊霉科占總AM 真菌的55%以上，是絕對優勢種群。該結果與Sun[38]、Wei[39]等的研究結論相一致。相關性分析結果顯示，土壤Cd 含量與球囊霉科含量呈顯著正相關（R2=0.786，P＜0.05）。與其他種屬相比，球囊霉的產孢速度更快，也更能適應于脅迫環境。但Schneider 等[40]則發現在巴西一處金礦土壤中主要的AM 真菌為類球囊霉、無梗囊霉和球囊霉。這說明不同生境條件下，土壤中AM 真菌群落結構并不完全相同。AM 真菌在植株根際定植成功，形成的共生結構使植物受益，反之植物也會選擇對其有益的AM 真菌[41]。因此，在應對Cd 脅迫時接種球囊霉將較類球囊霉對金葉六道木產生更大的益處，這也正是接種AM1后類球囊霉科增加對金葉六道木的促吸收效果不明顯的原因。

4 結 論

通過苗木篩選，發現金葉六道木對土壤重金屬Cd 具有較好吸收和富集能力。種植12 個月，植株體總Cd 含量達1745.46 μg·株–1。Cd 脅迫條件下，接種AM2（摩西球囊霉）后，金葉六道木根、莖和葉Cd 濃度分別為不接菌處理的2.64 倍、2.06 倍和1.76 倍。接種AM 真菌后根際土壤AM 真菌PLFA生物量增加，AM 真菌群落多樣性和豐富度下降，群落向著優勢種球囊霉科更加集中的方向發展。AM真菌強化了金葉六道木對土壤Cd 的吸收和修復能力，其聯合修復技術可擴展Cd 污染土壤植物修復的應用范圍。