卵黃替代血清檢測蛋雞H5、H7免疫抗體試驗

厲磊 秦燕 劉維紅 王冠東 邵春雷 王雷之

（山東省臨沂市畜牧發展促進中心 276000）

臨沂市是畜牧業大市，其中蛋雞養殖是部分農民發家致富的重要手段。禽流感是由A 型禽流感病毒引起的一種高度接觸性、急性傳染病。H5、H7亞型高致病性禽流感給養禽業造成的經濟損失巨大，被我國列為一類動物疫病。2004 年，我國開始對H5亞型高致病性禽流感實施強制免疫政策，2017 年又對H7亞型實行強制免疫。如何評價疫苗免疫效果尤為重要。每年本市根據省獸醫主管部門（省畜牧獸醫局）動物疫病監測計劃下達本行政區域的動物疫病監測計劃。雞高致病性禽流感免疫效果的監測，需要按一定比例采樣，抽取雞血析出血清后，做血凝和血凝抑制試驗來判定結果。采取雞血需要專業技術人員操作，并且需要采取必要的防護隔離措施，消耗大量的人力、物力。并且捉雞、采血使雞產生較大的應激反應，對蛋雞產蛋有一定的影響。母雞以特定抗原免疫后，能產生相對應的特應性抗體，抗體除存在于血清中外，還可以儲存于卵黃中，稱為卵黃抗體。因此，卵黃抗體與血清抗體應存在一定的相關性，若能收集蛋樣檢測卵黃抗體，則可以減少雞群采血應激[1]，而且操作更為方便。鑒于此，本中心于2019 年10～12 月，選擇了部分蛋雞場進行高致病性禽流感免疫注射和抗體水平檢測，并對血清抗體效價和卵黃抗體效價進行了比較分析，為生產實踐中產蛋雞卵黃抗體檢測H5、H7亞型禽流感免疫抗體提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

在蘭山區、河東區選擇6 個蛋雞養殖場，日齡均在180～190 日齡。

1.1.2 疫苗

重組禽流感（H5、H7）三價滅活疫苗（H5N1Re-11 株+Re-12 株、H7H9），哈藥集團生物疫苗生物疫苗有限公司生產。

1.1.3 檢測試劑

H5亞型（Re-11 株、Re-12 株）禽流感病毒血凝抑制試驗抗原及陽性血清，H7H9亞型禽流感病毒血凝抑制試驗抗原及陽性血清，均為哈爾濱維科生物科技開發公司產品，均在有效期內。

1.1.4 試劑

pH7.2 0.01mol/L PBS、1%雞紅細胞懸液均按照 《GB/T 18936-2003 高致病性禽流感診斷技術》 要求配置。

1.1.5 試驗器材

96 孔v 型微量反應板、單道、8 道移液器(品牌BRAND)、加樣吸頭、離心機、振蕩器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 疫苗注射

選6 個養殖場分別注射重組禽流感（H5+H7）三價滅活疫苗。

1.2.2 樣品采集

注射疫苗后14、21、28、40、50、60d 分別對應采集同一只雞血清和雞蛋。每個養殖場采集雞30 份。

1.2.3 樣品處理

血清樣品：無菌翅靜脈采血，室溫放置待血液凝固自然析出血清，必要時用低速（1500～2000r/min）離心5～10min，分離血清。

卵黃樣品：雞蛋清潔消毒，磕開瀝出蛋清，只留蛋黃在半邊蛋殼中。在樣品管中加入0.5mlPBS 液，再吸取0.5ml 卵黃做1:1 稀釋，振蕩器上混勻制成卵黃檢樣備用。

1.2.4 HI 抗體效價測定

取待檢血清樣品和卵黃樣品，按照GB/T 18936-2003 血凝（HA）試驗和血凝抑制(HI) 試驗進行H5、H7亞型禽流感免疫抗體檢測。

2 檢測結果

抗體HI 效價平均值統計結果見表1、表2、表3。

3 分析與討論

由表1、表2、表3 可知，疫苗免疫14～60d，H5、H7亞型禽流感抗體，卵黃抗體與血清中的抗體水平同升同降，免疫后40d 均達到最高值，說明二者的HI 抗體效價具有較強的相關性。

疫苗免疫14～28d，H5、H7亞型禽流感免疫抗體水平逐漸上升，但卵黃樣品的HI 效價比血清樣品的HI 效價低1～2 個滴度，這主要是因為抗體是由血液傳遞到卵黃的，卵黃的形成需要一定時間，所以卵黃抗體較血清抗體的檢測結果相比有一定滯后性[2]。

免疫28～60d，卵黃與血清樣品的禽流感抗體HI 效價（平均）基本一致，差異不顯著（＞0.05）。

4 小結

本試驗結果表明，蛋雞免疫重組禽流感三價疫苗28d 后，卵黃與血清抗體水平差異不顯著，具有較強的相關性，可以用卵黃代替血清進行禽流感免疫抗體檢測，應選擇在免疫28d 后。

用雞蛋檢測高致病性禽流感免疫抗體，采樣不需要專業技術，沒有外人進入、不用捉雞、采血，對雞不會造成任何應激，不會影響家禽的健康和生產性能，很好地緩解了養殖場戶對采樣的抵觸情緒，有利于免疫監測的順利進行。

表1 H5亞型Re-11 禽流感抗體HI 效價（平均）檢測結果統計(log2)

表2 H5亞型Re-12 禽流感抗體HI 效價（平均）檢測結果統計(log2)

表3 H7亞型禽流感抗體HI 效價（平均）檢測結果統計(log2)