QPRT、miR-26b-5p在乳腺癌中表達及其與患者預后的關系

袁南貴，羅雪平，胡玉萍，姚斌，黃偉玲

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發病率和病死率。2019年全世界發現乳腺癌約210萬，嚴重威脅女性健康[1]。乳腺癌的發生發展受多種因素、多種方式共同影響，基于美國國家生物信息中心的GEO數據庫中乳腺癌基因表達芯片顯示，與甘油酯類、活性氮類及輔酶類代謝過程相關基因的差異性表達可能與乳腺癌預后有關[2]。其中，喹啉酸磷酸核糖基轉移酶(quinolinic acid phosphoribosyltransferase，QPRT)是喹啉酸鹽代謝中的關鍵酶，可能參與乳腺癌輔酶代謝過程，并且QPRT高表達提示乳腺癌患者較低生存率，與患者預后不良有關[2]。關于QPRT與乳腺癌患者臨床病理參數的關系研究國內外鮮見報道。近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)在惡性腫瘤中的作用越來越受到關注，通過靶向mRNA的3’非翻譯區而抑制其靶基因的表達，參與腫瘤的增殖、分化、侵襲過程[3-4]。有研究發現，miR-26b-5p通過孕激素受體A亞型(progesterone receptor A，PR-A)受黃體酮激素調控，其表達水平與PR-A呈正相關，獨立介導乳腺癌細胞的侵襲和轉移[5]。因此，本研究通過檢測乳腺癌組織中QPRT、miR-26b-5p表達水平，探究其與乳腺癌患者預后的相關性，討論其潛在臨床價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月—2017年10月于廣州市中西醫結合醫院行乳腺癌改良根治術女性患者89例為觀察組，經病理組織檢查均為乳腺浸潤性導管癌，年齡29～67歲，中位數49歲；絕經55例；腫瘤直徑≥6 cm 52例，<6 cm 37例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期58例；低分化程度62例，中、高分化程度27例；有淋巴結轉移55例，無淋巴結轉移34例。同時取癌旁正常乳腺組織為對照組。本研究獲得醫院倫理委員會批準同意，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①術前均未接受任何輔助化療或內分泌治療；②病理組織石蠟標本均保存完整；③臨床資料完整。(2)排除標準：①合并其他腫瘤；②合并免疫缺陷、傳染性疾??；③因各種原因拒絕參與本研究者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 免疫組化法檢測QPRT表達水平：乳腺癌改良根治術后，將乳腺癌組織做成石蠟標本，連續切片厚度4 μm，進行脫蠟處理，采用鏈霉親合素—生物素復合物(SP)法染色，方法步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。一抗采用兔anti-QPRT單克隆抗體試劑盒(購自上海愛必信生物科技有限公司)按照1∶50稀釋，組織切片與一抗在4℃過夜，隨后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔IgG(1∶200，購自美國Abcam公司)孵育1 h，再加入SP孵育30 min，將每個切片在二氨基聯苯胺(DAB)工作液500 μl中室溫下浸泡3～10 min，蘇木素復染，脫水、透明、封片。用磷酸鹽緩沖液作為陰性對照。結果判定標準：(1)按染色強度記分，無染色為0分，淺黃色為1分，黃色或黃棕色2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞百分比記分，無陽性細胞記0分，陽性細胞<25%記1分，25%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。取2種方法得分的乘積，乘積0分為陰性(-)，1分為弱陽性(+)，2～3分為陽性(++)，>3分為強陽性(+++)；同時定義>3分為高表達，≤3分為低表達。

1.3.2 原位雜交技術檢測miR-26b-5p表達水平：石蠟切片經梯度脫蠟后利用3%雙氧水在室溫下浸泡10 min，蒸餾水清洗3遍，按照試劑盒說明書方法進行原位雜交，置于光學顯微鏡(德國徠卡公司，型號DM1000)觀察。 結果判定標準：(1)按染色強度，無染色或淺黃色顆粒為1分，黃色或黃棕色顆粒為2分，棕褐色顆?；驁F片狀為3分；(2)按陽性細胞百分比記分：無陽性細胞記0分，陽性細胞<10%記1分，10%～50%記2分，>50%記3分。取2種方法得分的乘積，乘積0分為陰性(-)，1分為弱陽性(+)，2～3分為陽性(++)，>3分為強陽性(+++)；同時定義>3分為高表達，≤3分為低表達。

1.3.3 記錄隨訪情況：患者術后即進行規范的后續治療并進入隨訪觀察，每3個月進行一次電話或門診隨訪，觀察記錄患者3年內復發、轉移情況。

2 結 果

2.1 乳腺癌組織與正常乳腺組織QPRT、miR-26b-5p表達比較 QPRT主要定位于細胞核和細胞質，miR-26b-5p主要定位于細胞質，見圖1、2。乳腺癌組織中QPRT表達(-)16例(17.98%)，(+～++)34例(38.20%)，(+++)39例(43.82%)，其陽性表達率82.02%，明顯高于癌旁正常乳腺組織的26.97%(χ2=54.395，P=0.000)；乳腺癌組織中miR-26b-5p表達(-)43例(48.32%)，(+～++)29例(32.58%)，(+++)17例(19.10%)，其陽性表達率51.68%，明顯低于癌旁正常乳腺組織的85.39%(χ2=23.448，P=0.000)，見表1。

表1 QPRT、miR-26b-5p在乳腺癌組織與正常乳腺組織中的表達比較 [例(%)]

圖1 QPRT在乳腺癌組織中的表達情況(免疫組化染色，×400)

圖2 miR-26b-5p在乳腺癌組織中的表達情況(原位雜交技術， ×400)

2.2 QPRT、miR-26b-5p在乳腺癌組織中表達的關系 利用Spearman分析乳腺癌組織中QPRT、miR-26b-5p表達關系，結果顯示二者表達呈負相關(r=-0.343，P=0.000)。

2.3 QPRT、miR-26b-5p在不同臨床/病理特征中表達水平比較 在乳腺癌組織中QPRT、miR-26b-5p高低表達水平在不同年齡、是否絕經、腫瘤直徑中比較，差異無統計學意義(P>0.05)，在不同TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移情況中比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌組織QPRT、miR-26b-5p在不同臨床/病理特征中表達水平比較 [例(%)]

2.4 QPRT、miR-26b-5p表達水平與乳腺癌患者術后復發轉移的關系 QPRT高表達組乳腺癌患者術后復發轉移率為65.38%(34/52)，明顯高于QPRT低表達組的29.73%(11/37)(χ2=13.260，P=0.000)；miR-26b-5p低表達組患者術后復發轉移率為63.79%(37/58)，明顯高于miR-26b-5p高表達組的25.81%(8/31)(χ2=12.550，P=0.000)，見圖3。

圖3 QPRT、miR-26b-5p表達水平與乳腺癌患者術后復發轉移的關系

2.5 影響乳腺癌患者術后復發轉移的COX多因素分析 分化程度低、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結發生轉移、QPRT高表達、miR-26b-5p低表達是影響乳腺癌患者術后復發轉移的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響乳腺癌患者術后復發轉移的COX多因素分析

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的癌癥，并逐漸成為影響女性健康的一個重要因素。近年來，全球乳腺癌的發病率和病死率持續上升，2019年美國約有26.8萬例乳腺癌新增病例和4.2萬死亡病例，其發病率和病死率分別排名第一、二位，占所有新發癌癥患者的30%和癌癥相關死亡人數的15%，中國和印度等發展中國家的乳腺癌發病率也呈逐年增長趨勢[6-9]，因此，早期診斷、及時治療對改善乳腺癌患者預后具有重要意義。

乳腺癌是一種高度異質性疾病，具有明顯的分子特征和基因表達特征[10-11]。隨著臨床治療的不斷優化，乳腺癌的病死率明顯下降，但其遠處轉移和復發在臨床上仍是一個巨大的挑戰。Xu等[12]利用4個基因表達數據集(GEO)和癌癥基因組圖譜(TCGA)對乳腺癌和正常組織的差異表達基因(DEGs)進行分析，結果發現547個DEGs(302個上調，245個下調)，最終確定了7個重要的預后候選基因，QPRT為其中之一。QPRT是一種新生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)合成途徑中的關鍵酶，以往研究發現QPRT與Wilms腫瘤基因1(WT1)關系密切，是白血病及其他惡性腫瘤的致癌基因[13-14]。QPRT在乳腺癌中的作用越來越受到重視。本結果顯示，QPRT在乳腺癌組織中的陽性表達率明顯高于正常乳腺組織，表明QPRT在乳腺癌中可能發揮癌基因作用。乳腺癌組織中QPRT表達水平在不同TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結有無轉移中比較差異有統計學意義，表明QPRT可能參與乳腺癌的增殖分化、轉移侵襲過程。有研究發現，與正常乳腺組織相比，QPRT在乳腺癌組織中過表達，且與患者進展不良有關；體外實驗發現，唐氏綜合征細胞黏附分子反義RNA1(DSCAM-AS1)通過競爭性結合miR-150-5p和miR-2467-3p增加QPRT表達，可促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，且抑制細胞凋亡[15]。提示QPRT可能與其靶基因結合而表達上調，參與乳腺癌的發生、發展進程。本研究還發現，QPRT高表達患者術后復發轉移率明顯高于QPRT低表達患者，且QPRT高表達是影響乳腺癌患者術后復發轉移的危險因素，表明QPRT高表達與患者預后不良有關，但具體作用機制尚不明了。

miRNA是一類進化高度保守的單鏈RNA，結合于靶基因的3’-非翻譯區，通過阻止翻譯或直接降解mRNA來抑制基因表達[16-18]。本研究結果顯示，miR-26b-5p在乳腺癌組織中陽性表達率顯著低于癌旁正常乳腺組織，并且其表達水平與患者TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及復發轉移有關，miR-26b-5p低表達是影響乳腺癌患者術后復發轉移的危險因素，表明miR-26b-5p可能參與乳腺癌患者腫瘤細胞分化、侵襲及轉移等病理過程。田連芳等[19]研究發現，miR-26b-3p在乳腺癌細胞系MDA-MB-453中表達最低，細胞實驗證實miR-26b-3p可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，通過與其下游靶基因E盒鋅指結合蛋白1(ZEB1)結合參與腫瘤的發展過程。另有研究認為[20]，miR-26b作為miR-26家族一員，其在炎性乳腺癌中的表達水平低于非炎性局部晚期乳腺癌，且均低于正常乳腺組織，這種表達下降可能與炎性表型、三陰性狀態及治療后腫瘤殘留有關；進一步研究發現，敲除miR-26b可靶向上調Zeste基因增強子同源物2(EZH2)蛋白表達，可能作為炎性乳腺癌和非炎性局部晚期乳腺癌的潛在治療靶點。本研究Spearman分析顯示，乳腺癌組織中QPRT和miR-26b-5p表達水平呈負相關，推測低表達的miR-26b-5p可能靶向上調QPRT表達參與乳腺癌的發生發展，具體作用機制有待進一步細胞實驗證實。

綜上所述，乳腺癌組織中QPRT表達上調，miR-26b-5p表達下調，二者可能存在靶向關系；其水平差異性表達與患者不良預后有關，可能作為治療乳腺癌的潛在靶點，具體機制值得進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

袁南貴：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；羅雪平：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；胡玉萍：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；姚斌：進行統計學分析；黃偉玲：課題設計，論文撰寫