血清miR-190b、IGF-1在不同臨床分期結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

周珩，曹會(huì)鯤，胡曉東，張任梓，倪秀茹

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著人們物質(zhì)生活水平提高、膳食結(jié)構(gòu)改變及人口老齡化的加劇，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均呈逐年上升的趨勢(shì)[1-2]。由于其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，導(dǎo)致該病早期診療存在困難[3-4]。因此，尋找結(jié)直腸癌病情相關(guān)診斷指標(biāo)，以提高其綜合治療效果具有重要的社會(huì)意義。微小RNA-190b(miR-190b)作為一條在高等動(dòng)物中高度保守的miRNA，廣泛分布于生物體內(nèi)，有研究表明，miR-190b能在結(jié)直腸癌中起抑癌基因的作用[5]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)分布于人體各組織，有合成代謝及促進(jìn)有絲分裂的作用，同時(shí)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。但目前關(guān)于血清IGF-1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌相關(guān)性的研究較少，因此，本研究分析結(jié)直腸癌患者血清miR-190b、IGF-1水平與臨床分期等臨床病理特征的關(guān)系，以期為疾病的病情評(píng)價(jià)、治療及預(yù)后改善提供一定參考依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年5月—2017年8月于北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院外科診治的結(jié)直腸癌患者82例作為結(jié)直腸癌組，其中男47例，女35例，年齡41～82(61.03±12.26)歲；腫瘤部位：結(jié)腸36例，直腸46例；腫瘤直徑<5.0 cm 48例，≥5.0 cm 34例；組織分化程度：高/中分化50例，低分化32例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例；T分期：T1～2期34例，T3～4期48例；N分期：N0期44例，N1～2期38例；M分期：M0期48例，M1期34例；AJCC分期：Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ～Ⅳ期36例。同期于醫(yī)院健康體檢者87例作為健康對(duì)照組，男46例，女41例，年齡40～83(60.84±12.37)歲。2組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均為自愿參加并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌者[7]；②臨床資料齊全者；③腫瘤遠(yuǎn)端距離肛緣≤10 cm者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①有細(xì)胞分子靶向治療史者；②哺乳期、妊娠期婦女；③伴有炎性腸病、家族性息肉病等結(jié)腸病變者；④伴有其他嚴(yán)重心、肝、腎等器質(zhì)性病變者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-190b表達(dá)： 健康體檢者當(dāng)天及結(jié)直腸癌患者手術(shù)第2天清晨空腹采集肘靜脈血5 ml， 離心 10 min后收集血清，置于-80℃保存待測(cè)。采用RNA提取試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司生產(chǎn))提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn))將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用qRT-PCR儀(美國(guó)ABI公司,型號(hào) ABI7500)對(duì)miR-190b及其內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系共20 μl：cDNA(50 ng/μl)2 μl，miScript SYBR?Green Mix 10 μl，正、反引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.4 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min,95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每份樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，采用2-△△CT法計(jì)算血清miR-190b相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 血清IGF-1水平檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)血清IGF-1水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司生產(chǎn))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 隨訪(fǎng)：采用電話(huà)或門(mén)診方式隨訪(fǎng)3年，術(shù)后第1年每月隨訪(fǎng)1次，術(shù)后第2年每3個(gè)月隨訪(fǎng)1次，2年后每6個(gè)月隨訪(fǎng)1次。其生存期從手術(shù)之日起計(jì)算，隨訪(fǎng)截至2020年8月。患者無(wú)失訪(fǎng)。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-190b、IGF-1水平比較 結(jié)直腸癌組血清miR-190b水平低于健康對(duì)照組，IGF-1水平高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 2組受試者血清miR-190b、IGF-1水平比較

2.2 不同臨床病理特征患者血清miR-190b、IGF-1水平比較 以結(jié)直腸癌患者血清miR-190b、IGF-1水平平均值(0.57、186.57 ng/ml)為界，miR-190b>0.57患者41例為高表達(dá)， miR-190b≤0.57患者41例為低表達(dá)； IGF-1>186.57 ng/ml患者40例為高表達(dá)，≤186.57 ng/ml患者42例為低表達(dá)。血清miR-190b、IGF-1表達(dá)水平在不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小患者中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者血清miR-190b、IGF-1水平比較 [例(%)]

2.3 不同臨床分期結(jié)直腸癌患者血清miR-190b、IGF-1水平比較 血清miR-190b、IGF-1水平在結(jié)直腸癌患者不同臨床分期(T分期、N分期、M分期、AJCC分期)中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同臨床分期結(jié)直腸癌患者血清miR-190b、IGF-1水平比較 [例(%)]

2.4 結(jié)直腸癌患者生存分析 隨訪(fǎng)3年，82例結(jié)直腸癌患者存活43例，死亡39例。miR-190b低表達(dá)患者3年內(nèi)生存率為36.59%(15/41)，低于miR-190b高表達(dá)患者的68.29%(28/41)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank=7.600，P=0.006)；IGF-1高表達(dá)患者3年內(nèi)生存率為38.09%(16/42)，低于IGF-1低表達(dá)患者的67.50%(27/40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank=9.061，P=0.003)，見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)直腸癌患者血清miR-190b、IGF-1表達(dá)與總生存率的關(guān)系

2.5 影響結(jié)直腸癌預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 排除性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小等混雜因素，以血清miR-190b、血清IGF-1、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期、N分期、M分期、AJCC分期為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，血清miR-190b低表達(dá)、IGF-1高表達(dá)、AJCC分期高是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)，見(jiàn)表5。

表5 影響結(jié)直腸癌預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

結(jié)直腸癌是目前較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年上升，對(duì)人類(lèi)的生命健康和生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重的損害[8-9]。目前通過(guò)臨床手術(shù)及化療等手段治療結(jié)直腸癌已取得了一定的進(jìn)展，但其預(yù)后仍不十分理想[10-11]。因此，探尋影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因素并對(duì)這些因素進(jìn)行積極干預(yù)具有重要的理論和實(shí)踐意義，且對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究可能有著重要的指導(dǎo)價(jià)值，進(jìn)而為疾病治療及預(yù)后改善提供可靠的依據(jù)。

miR-190b位于基因Talin2的內(nèi)含子中，在不同物種間較為保守，在多數(shù)腫瘤組織中異常表達(dá)，且在原發(fā)灶腫瘤組織與遠(yuǎn)端遷移腫瘤組織中表達(dá)量差異較大[12-14]。相關(guān)研究表明，miR-190b可通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)抑制骨肉瘤細(xì)胞與胃癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而控制腫瘤患者病情發(fā)展[15-16]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血清miR-190b水平低于健康人群，與王勝等[17]研究結(jié)果中miR-190b表達(dá)趨勢(shì)一致。miR-190b低表達(dá)患者3年內(nèi)生存率低于miR-190b高表達(dá)患者，且miR-190b低表達(dá)是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清miR-190b低表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切聯(lián)系。推測(cè)其可能機(jī)制為miR-190b可在一定程度上起到抑癌基因的作用，而血清miR-190b表達(dá)水平降低會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖，進(jìn)而使腫瘤表面的血管形成增加，最終加快了結(jié)直腸癌發(fā)展速度，加重患者病情，增加不良預(yù)后。但有學(xué)者通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究顯示[18]，miR-190b在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)，而下調(diào)miR-190b可減少結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及集落形成和侵襲，此結(jié)果與本研究結(jié)果截然不同,通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致此種現(xiàn)象的原因是由于研究?jī)?nèi)容不同，臨床與實(shí)驗(yàn)可能還存在一定的差異，或可能由于納入樣本量較少等原因?qū)е拢虼诉€應(yīng)加大樣本量從不同角度進(jìn)行深入分析。

IGF-1是一種多肽類(lèi)蛋白質(zhì)，可通過(guò)與其受體IGF-1R特異性結(jié)合，進(jìn)而激活胰島素受體底物蛋白通路，促進(jìn)細(xì)胞遷移和增生[19]。IGF-1可在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均發(fā)揮強(qiáng)有絲分裂及促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行的作用[20]。本研究結(jié)果中結(jié)直腸癌患者血清IGF-1水平高于健康人群，與周玲玲等[21]研究結(jié)果基本一致。IGF-1高表達(dá)患者3年內(nèi)生存率低于IGF-1低表達(dá)患者，且IGF-1高表達(dá)是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清IGF-1可能通過(guò)高表達(dá)影響結(jié)直腸癌病情發(fā)展及預(yù)后不良，推測(cè)IGF-1表達(dá)水平升高后，增加了與其受體IGF-1R結(jié)合幾率，二者結(jié)合后經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)有絲分裂加速細(xì)胞周期運(yùn)行，以促進(jìn)細(xì)胞增生及遷移，進(jìn)而誘發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖增生，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，最終造成患者復(fù)發(fā)、死亡等不良預(yù)后。此外，本研究結(jié)果還顯示，血清miR-190b、IGF-1與結(jié)直腸癌臨床病理特征均有相關(guān)性，且AJCC分期是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清miR-190b、IGF-1水平可能與腫瘤的惡性程度有關(guān)，對(duì)于miR-190b低表達(dá)、IGF-1高表達(dá)、AJCC分期為Ⅲ～Ⅳ期等患者，術(shù)后應(yīng)給予針對(duì)性治療及護(hù)理，以改善不良預(yù)后。

綜上所述，血清miR-190b、IGF-1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床分期等臨床病理特征密切相關(guān)，可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)。血清miR-190b、IGF-1有望成為干預(yù)結(jié)直腸癌的潛在生物學(xué)靶點(diǎn)，為進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌的病理機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為結(jié)直腸癌診斷、治療方案的確定及預(yù)后的改善提供了有利的參考。而本研究還存在諸多不足之處，包括納入樣本量較少，未開(kāi)展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，關(guān)于其具體的分子機(jī)制尚不明確等，還有待進(jìn)一步更深入分析。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

周珩：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；曹會(huì)鯤：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；胡曉東：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；張任梓：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；倪秀茹：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)