基于生物信息數據研究腫瘤突變負荷在結腸癌中的臨床意義

趙棟燕，孫希珍，姚樹坤

結直腸癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，其發病率和病死率都很高[1]。近年來結腸癌的經濟負擔在發展中國家逐漸增長，預計到2030年新發病例將超過220萬，死亡人數將達到110萬[2]。雖然目前化療、手術、靶向治療、放療等多種治療方法可提高結腸癌患者的生存率并減少其復發，但晚期結腸癌患者5年生存率仍然很低[1]。因此，迫切需要新的治療方法來延長患者的生命。最近在實體腫瘤的治療策略中，以免疫檢查點抑制劑為代表的免疫療法已成為最有前途的方法之一。美國食品藥品監督管理局已經批準免疫檢查點抑制劑應用于實體腫瘤的治療，如結直腸癌、肺癌、黑色素瘤等[3-4]。然而，由于腫瘤的遺傳異質性，僅有小部分患者對免疫治療呈現陽性反應。因此亟待可靠的生物標志物來預測免疫治療的療效。

腫瘤突變負荷(tumor mutation burden, TMB)是指體細胞基因非同義突變的分布密度，即外顯子編碼區域內每Mb堿基中編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失的總數。目前TMB被認為是免疫檢查點抑制劑的新型生物標志物，能夠預測免疫治療的療效[5]。有研究表明，具有較高突變負荷的腫瘤能夠在腫瘤細胞表面募集到更多的新抗原，增加腫瘤的免疫原性，從而提高免疫治療的療效[6]。然而，結腸癌中關于TMB的研究較少。因此本研究應用癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas, TCGA)探討結腸癌的基因突變特征及TMB在結腸癌中的臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料獲取 通過癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫下載結腸癌患者399例的體細胞突變數據、基因表達數據及相關的臨床數據(https://portal.gdc.cancer.gov/repository)。體細胞突變數據經過VarScan軟件處理，并使用R軟件(版本3.6.1)的maftools函數包進行特征性分析與可視化。

1.2 TMB的計算及預后分析 通過基于JAVA8平臺的Perl腳本計算每個樣本的TMB值，表達為體細胞突變總數/測序區域大小，單位為mutations/Mb。接著對TMB值降序排列，按中位數將所有腫瘤樣本分為高TMB組及低TMB組，根據每個樣本的臨床數據采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗分析TMB與總生存率的關系。應用Wilcoxon秩和檢驗分析TMB值與臨床病理參數如性別、年齡、腫瘤分期、體質量指數(BMI)等的關系。

1.3 基因富集分析 根據TMB中位數將基因轉錄數據分為高低2組，通過基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)軟件進行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)和GO(gene oncology)富集分析，設定隨機組合次數為1 000 次。當標準化富集分數(NES)>1、標準化顯著性水平(NOM)P<0.05和矯正多重假設檢驗(FDR)q<0.25,則認為富集的基因集有臨床意義。

1.4 TMB與浸潤性免疫細胞 基于RNA-seq表達數據，本研究使用CIBERSORT函數定量分析每個腫瘤樣品中22種浸潤性免疫細胞的豐度，閾值設置為P<0.05。應用Wilcoxon秩和檢驗分析高TMB組與低TMB組浸潤性免疫細胞的占比差異，并通過vioplot函數包進行數據可視化，對比分析2組之間CD8+T細胞、調節性T細胞(Treg)、M1巨噬細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)表面標記的差異，免疫細胞標記從R&D Systems獲取(https://www.rndsystems.com/cn/resources/cell-markers/immune-cells)。

1.5 TMB與免疫檢查點分子 應用Wilcoxon秩和檢驗對比高TMB組與低TMB組之間免疫檢查點分子，包括程序性死亡受體1(PD-1)、程序性死亡受體配體1(PD-L1)及細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)的基因表達差異，應用Spearman相關性分析研究TMB值與免疫檢查點分子表達量之間的關系。

1.6 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。運用Wilcoxon秩和檢驗分析2組之間的差異，采用Kaplan-Meier法與log-rank檢驗進行生存分析。應用R軟件(版本3.6.1)及GraphPad Prism 8進行圖像繪制。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 結腸癌基因突變數據 399個結腸癌樣本中有398個樣本存在變異，變異數0～7 278，中位數96。錯義突變和單核苷酸多態性是最常見的突變類型，突變率最高的單核苷酸變異是C>T(圖1A)。瀑布圖顯示突變率最高的前10位基因是APC、TP53、TTN、KRAS、SYNE1、PIK3CA、MUC16、FAT4、ZFHX4、RYR2(圖1B)。

注：A.突變信息概況；(a).突變類別；(b).變異類型；(c).單核苷酸變異類型；(d).每個樣本的突變數目；(e).突變類別概況；(f).十大突變基因；B.結腸癌前30個突變基因的瀑布圖；SNV.單核苷酸變異；SNP.單核苷酸多態性；INS.插入；DEL.缺失

2.2 TMB在結腸癌中的預后價值 根據TMB中位數(3.132 mutations/Mb)將結腸癌樣本分為高TMB組(n=207)和低TMB組(n=192)，通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線，發現高TMB組患者的生存率明顯低于低TMB組患者(χ2= 5.351，P=0.021)，高TMB組的5年生存率為0.574(95%CI0.468～0.703)，而低TMB組患者的5年生存率為0.632(95%CI0.507～0.789)。另外，比較TMB在不同亞組間的表達差異，結果發現在年齡>65歲、BMI>28 kg/m2、腫瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期及無淋巴結和無遠處轉移的患者中TMB表達較高(P<0.05)，在性別、T分期中差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

注：A.結腸癌患者TMB與總生存率的關系；B～H.結腸癌患者TMB值與性別、年齡、BMI、臨床分期等臨床特征的相關性分析

2.3 基因富集分析 GSEA分析提示共有18個KEGG通路(圖3A)及336個GO通路(圖3B，僅展示前20 個通路)在高TMB組中有不同程度的富集。這些通路及生物過程多與免疫相關：Toll樣受體信號通路、產生IgA的腸道免疫網絡、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、B細胞內穩態、淋巴細胞凋亡過程等。

注：A.KEGG通路；B.GO通路

2.4 TMB與浸潤性免疫細胞的關系 高TMB組的患者CD8+T細胞、活化的CD4+記憶性T細胞、活化的NK細胞及M1巨噬細胞的浸潤程度明顯高于低TMB組(Z/P=-2.151/0.032，-1.988/0.047，-3.090/0.002，-2.783/0.005)，低TMB組Treg和M0巨噬細胞的浸潤程度明顯高于高TMB組(Z/P=-2.494/0.013，-2.114/0.035)，見圖4。為了進一步驗證上述結果，分析了高TMB組與低TMB組之間免疫細胞表面標記的基因差異， 發現2組Treg的表面標記FOXP3與CCR8基因表達水平差異無統計學意義(Z/P=-0.309/0.757，-0.732/0.464)，M1巨噬細胞的表面標記NOS2、CD80和CD86在高TMB組明顯升高(Z/P=-3.006/0.003，-2.710/0.007，-2.167/0.030)，CD8+T細胞的表面標記CD8A在高TMB組表達升高(Z/P=-3.242/0.001)，NK細胞的表面標記KIR3DL1和CD7在高TMB組的基因表達水平顯著高于低TMB組(Z/P=-2.085/0.037，-3.498/<0.001)，見圖5。

圖4 2組22種浸潤性免疫細胞的表達比較

圖5 2組CD8+ T細胞、M1巨噬細胞、調節性T細胞和NK細胞基因標記的表達差異

2.5 TMB與免疫檢查點分子的關系 在高TMB組中，免疫檢查點分子PD-1、PD-L1和CTLA-4的基因表達水平顯著高于低TMB組，差異有統計學意義(Z/P=-3.489/<0.001,-4.813/<0.001,-3.363/<0.001)。相關分析結果表明，在結腸癌患者中，TMB值與PD-1、PD-L1與CTLA-4的基因表達水平均呈正相關(r/P=0.24/0.01,0.35/<0.01,0.25/<0.01)，但相關性不強，見圖6。

注：A.2組免疫檢查點分子的基因表達差異；B.結腸癌患者TMB與免疫檢查點分子的相關性分析

3 討 論

近年來，癌癥的治療策略發生了巨大變化，新型治療方法包括免疫治療在內取得了較大成果。隨著治療策略的變化，具有臨床可行性的腫瘤生物標志物已經從影像學資料向基因轉變。既往研究揭示了幾種新型生物標志物用來預測免疫檢查點抑制劑的治療效果，如PD-1/PD-L1表達、錯配修復缺陷、腫瘤浸潤性淋巴細胞[7]。隨著高通量測序技術的發展，腫瘤突變負荷作為一種可能識別免疫治療反應的潛在生物學標志物受到了巨大的關注。已有研究證實具有高突變負荷的腫瘤如膀胱癌與肺癌對免疫檢查點抑制劑有較好的反應[4, 8]。因此,探索腫瘤突變負荷在結腸癌中發揮的作用及其與臨床預后的關系具有重要意義。

在本研究中，筆者發現了錯義突變、單核苷酸多態性及C>T突變是結腸癌最常見的突變類型，而這些突變類型在腫瘤的發生、發展及預后中發揮著重要作用。突變率最高的前3個基因是腺瘤性結腸息肉病基因(APC)、TP53、肌聯蛋白(TTN)。APC與TP53均為抑癌基因，其突變可促進結腸腺瘤向結腸癌轉變，被認為是結腸癌發生的關鍵[9]。TTN是目前已知最長的基因，已經證實TTN與TMB表達水平的高低及免疫治療的反應密切相關[10]。研究這些高突變的基因在結腸癌中的作用，對于明確結腸癌的發病機制、進展過程有重大意義。

在結腸癌中，TMB與患者的生存狀況及臨床病理特征之間的關系尚未明確。筆者以TMB的中位數(3.132 mutations/Mb)作為分界線，將結腸癌患者分為高TMB組和低TMB組，在此基礎上發現高TMB組的患者預后明顯差于低TMB組，并且差異具有統計學意義(P<0.05)。另外，筆者分析了不同臨床亞組間TMB的差異。突變負荷升高不僅多見于高齡肥胖的患者，還見于腫瘤早期、無淋巴結與遠處轉移的患者。腫瘤早期患者生存期應該較長，但此處卻出現相反的結果，這可能與患者接受的治療措施不同有關，遺憾的是此數據庫并未提供每個樣本的具體治療方法。微衛星不穩定性(microsatellite instability, MSI)是一種已建立的用來預測免疫治療效果的生物指標，其特征是錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的缺陷。有研究表明，在高MSI的結腸癌中，突變負荷越高，患者越容易受益于免疫治療，患者預后越佳[11]。在一個小樣本結腸癌研究中，以6 mutations/Mb為臨界線劃分高低突變組，結果發現高突變負荷組患者化療效果優于低突變負荷組，生存期延長[12]。可以看出，在這些研究中，高TMB是結腸癌的良好預后因素。筆者的研究結果與既往研究不同，可能是因為所采取的治療方法不同。另外，TMB在不同腫瘤的預后價值也存在著較大的爭議。在腎透明細胞癌與前列腺癌研究中，同樣以中位數為界線劃分高低負荷組，高突變負荷組的患者往往伴隨著較差的預后[13- 14]；在肝細胞癌患者中，突變負荷對患者的預后沒有影響[15]；而在膀胱癌患者中，突變負荷越高則意味著患者生存時間越長[16]。因此，需要大樣本的研究來明確突變負荷在不同腫瘤預后中的影響。

目前，腫瘤突變負荷在結腸癌中的具體調控機制尚不清楚。在基因富集分析的結果中，高突變負荷組的富集通路多與免疫相關。有研究表明，腫瘤細胞的突變負荷表達增加，可促進細胞表面的新抗原積聚，增加其自身免疫原性，從而激活免疫細胞及其介導的抗腫瘤免疫反應[6]。在腫瘤微環境中，浸潤性免疫細胞占很大比例，它們通過釋放炎性細胞因子和趨化因子與腫瘤細胞相互作用，驅動癌癥的生物學行為。因此，有必要探索突變負荷與腫瘤微環境中免疫細胞的潛在聯系。在高TMB患者中，CD8+T細胞、CD4+T細胞、NK細胞及M1巨噬細胞的占比顯著高于低TMB組，其基因標志的表達在2組之間差異也具有統計學意義，這些細胞均在抗腫瘤免疫中發揮著重要作用。有研究證實，間質細胞表達的免疫檢查點分子PD-L1可抑制CD8+T細胞，從而促進結腸癌腫瘤細胞的增殖與轉移[17]。CD4+T細胞是抗腫瘤免疫機制中的重要組成部分，并且與抗原處理過程密切相關，被認為是多種腫瘤的獨立預后指標[18-19]。NK細胞在高TMB組顯著增多，而基因富集結果提示高TMB組在NK細胞介導的細胞毒性通路中明顯富集，進一步驗證了此結果。巨噬細胞在腫瘤中的作用取決于自身的極化狀態。M1巨噬細胞具有抗腫瘤的特性，而M2巨噬細胞則促進腫瘤的增長[20]。在高TMB組患者中，M0巨噬細胞占比下降，而M1巨噬細胞升高，可能的解釋是突變負荷升高促進腫瘤細胞釋放某些因子誘導M0巨噬細胞向M1極化。Treg與多種腫瘤的不良預后相關，能夠有效地抑制抗腫瘤免疫反應[21]。雖然Treg在低突變負荷組顯著升高，但是其標志基因在2組之間卻無明顯差異，因此TMB與Treg之間的關系仍需要進一步研究。從上述可知，在高突變負荷的結腸癌患者中，腫瘤微環境呈現出明顯的抗腫瘤免疫狀態。未來可以從腫瘤微環境入手，進一步探索TMB在結腸癌中的作用機制。

本研究還探討了突變負荷與免疫檢查點分子之間的關系。免疫檢查點分子是一類能夠調控免疫細胞，在免疫穩態中發揮重要作用的調節蛋白，其中常見的是PD-1、PD-L1與CTLA-4。免疫檢查點分子能夠抑制免疫細胞特別是T細胞的活化及其產生的抗腫瘤反應，從而使腫瘤逃避免疫監視[22]。在結腸癌中，筆者發現高TMB組患者免疫檢查點分子PD-1、PD-L1與CTLA-4的基因表達均明顯增高，提示免疫檢查點抑制劑應用于這一類患者可能有效地恢復腫瘤微環境的免疫應答，取得良好的治療效果。既往研究表明，在大多數腫瘤中PD-L1表達與突變負荷相互獨立[8]。在結腸癌中，TMB與免疫檢查點分子的基因表達相關性較弱，提示TMB在結腸癌中是獨立于PD-L1的生物標志物。

本研究存在一些不足之處，僅納入了TCGA這一個數據庫，沒有采用外部數據庫如GEO數據庫(Gene Expression Omnibus database)或其他大樣本的隊列進行驗證；在本研究中，筆者以中位數為臨界值區分高低突變負荷組，然而，如何定義突變負荷的高低水平并沒有定論。在一項大樣本多腫瘤的研究中，研究者將TMB分為3個亞組：高TMB組(占患者總數的50%)、中TMB組(占比40%)、低TMB組(占比10%)[23]。另外一項大規模研究中，研究人員將前20%TMB的患者定義為高突變負荷組，分析了在多種腫瘤中TMB與免疫療效之間的關系[24]。TMB的閾值也會受到其他因素的影響，如腫瘤類型、樣本類型、檢測方法、樣本采集過程等[22]。單純地以中位數作為臨界來劃分高低突變負荷并不十分科學，需要進行關于免疫治療的大樣本臨床研究，以患者的療效作為評判標準來尋找一個能夠在臨床上進行推廣的臨界值。另外，筆者分析了TMB與浸潤性免疫細胞的關系，但并沒有進行基礎實驗在細胞和分子水平探索TMB對免疫細胞的調控機制。未來可以從這個方向出發深入研究，可能會為結腸癌的治療提供新的方向。

綜上所述，高TMB患者總生存時間短于低TMB的患者。突變負荷升高可引起腫瘤微環境中浸潤性免疫細胞的成分發生明顯變化，并產生抗腫瘤免疫反應。另外，突變負荷表達升高伴隨著免疫檢查點分子PD-1、PD-L1與CTLA-4的基因表達增高，這些結果均提示高TMB患者更有可能受益于免疫治療。因此，TMB有望成為結腸癌預后及免疫治療的生物標志物，為結腸癌的免疫治療提供新的研究方向。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

趙棟燕：設計研究方案，統計分析，論文撰寫；孫希珍：統計分析，論文修改；姚樹坤：課題設計，論文終審