超高效液相色譜-串聯質譜法測定沙拉醬中16種喹諾酮類藥物殘留

◎ 黃思聰，楊建濤，黃象金

（肇慶市食品檢驗所，廣東 肇慶 526040）

喹諾酮類藥物是以4-喹諾酮為母核的一類廣譜抗生素，因其價格低廉且抗菌譜廣，廣泛運用于動物及水產養殖[1]。長期攝入喹諾酮類抗生素，會使人體出現過敏反應和變態反應，影響免疫系統功能，產生耐藥性，不利于疾病治療[2-3]。目前，世界衛生組織（WTO）、歐盟及我國都對喹諾酮類抗生素在養殖方面有著嚴格的使用標準。根據我國農業部公告第278號，禁止在產蛋雞中使用達氟沙星、培氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、二氟沙星、沙拉沙星和洛美沙星等各種形式的制劑；頒布于2015年的農業部公告第2292號，則決定對用于食品動物中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星4種原料藥及制劑停止生產、經營及使用。

從過往的監測數據可以得知，雞蛋、雞肉類的喹諾酮類抗生素濫用問題依然突出[4-10]。而針對以雞蛋為重要原材料的沙拉醬，目前并沒有有效的檢測喹諾酮類抗生素的方法或標準。截至2017年，沙拉醬行業產量約20.2萬t，表觀消費量約18.9萬t[11]。面對如此龐大且不斷增長的消費市場，建立一個單獨和新型的檢測技術或方法顯得越來越迫切。

目前，測定喹諾酮類抗生素殘留的檢測方法有酶聯免疫法[12-13]、高效液相色譜法（HPLC）[14-16]、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）[17-18]。相對于酶聯免疫法具有較高的檢出限；HPLC靈敏度低，無法提供目標物的結構信息；LC-MS/MS對目標物的分離能力強、靈敏度更高、操作方便，更適合對低殘留多組分的同時測定。前處理方法主要有液液萃取法[19]、QuEChERS[20-22]、固相萃取法[22-26]等。

除雞蛋外，沙拉醬中的大量色拉油亦是導致影響檢測結果的重要因素，因此，選擇一種高效準確的前處理方法同樣很有必要。本研究運用Captiva EMR-Lipid 固相萃取技術，對沙拉醬中的16種喹諾酮類抗生素進行提取凈化，該技術具有回收率和準確率高，分析速度快等優點，進一步聯合UPLC-MS/MS法，達到更加高效準確地對沙拉醬中喹諾酮類抗生素殘留量的 測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、達氟沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、司帕沙星、伊諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、惡喹酸、西諾沙星和氟甲喹標準物質，純度均大于97%，德國Dr.Ehrenstorfer公司生產；乙腈、甲醇、甲酸，質譜純，美國Merck公司生產。

1.2 儀器與設備

UPLCH-class/Xevo TQD超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀（美國Waters公司）、XSE205DU電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、comfortⅡ超純水系統（德國Sartorius公司）、MultiReax多試管振蕩器（德國heidolph公司）、H1750R高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）、EVA-60全自動濃縮儀（美國Reeko公司）及Captiva EMR-Lipid凈化柱（美國安捷倫公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

嚴格稱取粉碎混勻后的沙拉醬樣品4.0 g，置入 50 mL離心管中，再精確加入80%乙腈水（含5%甲酸）10 mL及一顆陶瓷均質子，渦旋振蕩1 min，振蕩提取2 min，10 000 r·min-1在4 ℃離心5 min，室溫靜置；準確移取5.0 mL上清液經Captiva EMR-Lipid凈化柱凈化，重力自流，輕度負壓抽干小柱，收集流出液，用40 ℃氮吹濃縮近干，再加入1.0 mL初始流動相復溶，通過0.22 μm微孔濾膜過濾，最后濾液供UPLC-MS/MS 測定。

1.3.2 溶液配制

標準儲備液：準確稱取喹諾酮類抗生素標準品各10 mg，分別溶解于甲醇中，并定容至100 mL，最后配制成100 μg·mL-1質量濃度的標準儲備液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇；流速 0.35 mL·min-1；進樣量2.0 μL；柱溫35 ℃。梯度洗脫 程 序：0～1 min，95%流 動 相A；1～4 min，95%→65%流動相A；4～7 min，65%→5%流動相A；7～7.1 min，5%→95%流動相A；7.1～10 min，95%流動相A。

1.3.4 質譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；掃描模式：多反應監測（MRM）；碰撞氣：氬氣，純度＞99.999%；脫溶劑氣溫度：550 ℃；脫溶劑氣：氮氣，流速1000 L·h-1；毛細管電壓：1.0 kV。

1.4 數據處理

每組實驗重復6次，結果表示為平均值，采用SPSS 16.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

將濃度為1.0 μg·mL-1的喹諾酮類抗生素單標通過質譜端蠕動泵進樣。在正離子模式下，通過一級質譜掃描（MS1 Scan），調節毛細管電壓（Capilary）、脫溶劑氣流量、脫溶劑氣溫度以獲取穩定的、響應強度最大的[M+H]+分子離子，以確定母離子；通過子離子掃描模式（Daughter Scan）在50～400 m/z范圍內找出豐度較強的碎片離子，選擇豐度最強的碎片離子為定量離子，優化后的碰撞能量（Collision）、錐孔電壓（Cone）等參數如表1所示。

表1 分析物的線性范圍、相關系數、保留時間及質譜參數表

2.2 提取溶劑的選擇

根據喹諾酮類抗生素的極性，結合Captiva EMRLipid前處理方法，分別選擇甲醇、乙腈、酸化乙腈和EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取溶劑，比較空白沙拉醬加標回收實驗提取效果。結果表明，由于沙拉醬的脂肪含量高達76.2%，乙腈具有較強的提取能力，對喹諾酮類抗生素的提取效果最好，結合Captiva EMRLipid方法可有效去除蛋白質和脂肪；根據喹諾酮類化合物易溶于酸性或堿性溶液的特質，因此在本實驗中分別采用1%、2%和5%的甲酸乙腈進行提取，發現當甲酸濃度為5%時，蛋白沉淀效果最好；對5%的甲酸乙腈進一步添加20%的水，樣品分散和目標物釋放更快更徹底，同時可以更好地活化Captiva EMR-Lipid柱。因而本實驗選用80%乙腈水（含5%的甲酸）作為提取溶劑。

2.3 流動相的選擇

采 用Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）作為分析柱，考察甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨和乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨流動相對喹諾酮類抗生素的分離效果及其質譜響應情況。結果表明，在ESI源正離子模式下，流動相中添加甲酸，通過幫助溶液中的正離子質子化，進而產生更強的電噴霧信號，提高目標物質檢測的靈敏度，且峰形良好，故選用0.1%甲酸水作為水相；另外，使用甲醇相對乙腈，分離效果和響應強度更佳。綜合分析，采用甲醇-0.1%甲酸水為流動相時，喹諾酮類抗生素的質譜響應值較高，且經梯度洗脫后能夠有效分離（見圖1）。因此選擇甲醇-0.1%甲酸水作為流動相。

2.4 樣品凈化方法的選擇

使用QuEChERS-EMR-Lipid（以下簡稱Q-EL）和Captica EMR-Lipid（以下簡稱C-EL）兩種提取凈化方式分別對濃度為1.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1、 100.0 μg·kg-1的3組加標樣品進行測定，每個添加水平測定6次，對結果進行比較。結果表明，Q-EL法的加標回收率為47.5%～103.0%，RSD值為1.1%～10.9%；C-EL法的加標回收率為72.5%～104.0%，RSD為1.3%～7.5%。這是因為在凈化過程中，Q-EL法是先對目標物中的脂質進行選擇性萃取，去除多余的水分從而改善對目標物的分配，但由于其除脂作用依靠的是無水MgSO4，MgSO4遇水會結塊，影響環丙沙星、培氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星和吡哌酸這幾種藥物的凈化效果，導致回收率偏低；而C-EL法由于采取體積排阻和疏水相相互作用捕獲脂類，將體積較大的分析物排阻出去，可以最大限度地減少離子抑制對目標分析物的影響。

因而相對Q-EL法，使用C-EL法的可靠性和穩定性更高，可以達到更好的凈化效果，回收率更高，精密度更理想。不同的處理方法平均回收率和精密度見表2。

圖1 喹諾酮類抗生素提取離子總離子流圖

表2 不同的處理方法平均回收率和精密度表（n=6）

2.5 基質效應的消除

采用UPLC-MS/MS分析樣品時，基質效應是影響定量結果準確性的重要因素。因而為消除 UPLC-MS/MS法測定沙拉醬基質中喹諾酮類抗生素的基質效應，采用標準添加法，分別對純溶劑以及不含目標物的空白沙拉醬樣品的基質效應進行分析，按式（1）計算基質效應ME值。

式（1）中，Sm為空白基質匹配標準曲線的斜率，Ss為純溶劑標準曲線的斜率。若ME＞0，表現為基質增強效應；若ME＜0，表現為基質抑制效應。基質效應測定結果見表3。

表3 基質效應表（n=6）

由表3可知，在純溶劑和不含目標物的空白沙拉醬樣品兩種基質中分別加入1 μg·kg-1、10 μg·kg-1、25 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-1和200 μg·kg-1的喹諾酮類抗生素標準溶液，按上述Captica EMRLipid固相萃取-UPLC-MS/MS法測定目標物質譜響應強度，重復測定6次，取6次平均響應值分別制得基質匹配曲線和溶劑標曲線，得出ME值為-0.3%～9.8%，表明在0.1～200.0 μg·kg-1質量濃度范圍內，采用Captica EMR-Lipid固相萃取-UPLCMS/MS法測定沙拉醬中喹諾酮類抗生素時存在基質干擾，表現為基質增強效應。本實驗采用基質匹配方法消除基質效應影響，對16種化合物均采用基質匹配外標校正的方法，以確保實驗結果的準確性。

2.6 線性范圍、檢出限與定量限

按 照0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、 10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1共8個質量濃度對喹諾酮類抗生素標準溶液進行配制，使用UPLC-MS/MS法測定，橫坐標（x）表示目標物質量濃度，縱坐標（y）表示質譜響應值，據此繪制標準曲線。以信噪比S/N=3結合空白基質噪音響應確定方法的檢出限（LOD）為 0.5 μg·kg-1，以信噪比S/N=10確定方法的定量限（LOQ）為2.0 μg·kg-1。由表1可知，在0.5～200.0 ng·mL-1范圍內，喹諾酮類抗生素質量濃度與其質譜響應值呈良好的線性關系，相關系數均大于0.996 5。

2.7 加標回收率和精密度

對不含目標物的空白沙拉醬樣品，依次添加 1.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1、100.0 μg·kg-1的16種喹諾酮類抗生素標準溶液，同樣使用上述UPLC-MS/MS法對每個添加水平進行6次測定，進一步計算回收率和相對標準偏差（RSD），由表2可知，在1.0～100.0 μg·kg-1加標范圍內，喹諾酮類抗生素的平均加標回收率為72.5%～104.0%，RSD為1.3%～7.5%，測定結果達到方法學的要求，表明該方法具有較高的準確度和良好的精密度。

2.8 實際樣品分析

按本研究所建立的Captica EMR-Lipid固相萃取-UPLC-MS/MS法測定20份市售沙拉醬中喹諾酮類抗生素殘留量，均未檢出氧氟沙星、恩諾沙星等16種喹諾酮類抗生素的殘留。

3 結論

本研究采用Captica EMR-Lipid技術提取凈化沙拉醬中的氧氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、達氟沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、司帕沙星、依諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、惡喹酸、西諾沙星和氟甲喹，成功建立UPLC-MS/MS法同時測定沙拉醬中喹諾酮類抗生素的方法。該方法前處理過程簡單、靈敏度和準確度高、分離效果好，可為沙拉醬中喹諾酮類抗生素殘留檢測及確證提供新的方向；同時對進一步加強我國食品檢測技術能力，彌補該領域食品檢測技術的空白及保障食品安全具有十分重大的意義。